轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析PM2.5與小鼠腸道疾病發(fā)生的關(guān)系

苗成利 孫春艷 黃梅 郎元君 陳偉達(dá) 陳小兵 羅成華

(1北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院腹膜后腫瘤外科，北京 102206；2北京源宜基因科技股份有限公司)

近年來(lái)，我國(guó)各地空氣污染的情況愈加嚴(yán)重〔1〕。造成空氣污染的污染物質(zhì)往往是由多種不同的化合物組成的混合物，包括顆粒物(PM)、有毒氣體、有機(jī)化合物及有毒金屬等〔2〕，其中PM2.5(PM≤2.5 μm，空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的大氣懸浮顆粒物)是一種對(duì)人體健康威脅最大的空氣污染物〔3〕。PM2.5不僅能增加人體呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率，引起哮喘、肺功能下降、呼吸系統(tǒng)炎癥〔4,5〕，還能夠沉積于肺泡表面并通過(guò)肺呼吸屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)〔6〕，對(duì)組織細(xì)胞造成損害，引起心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤等〔7,8〕。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5自身帶有大量活性氧(ROS)，能夠激活細(xì)胞氧化反應(yīng)信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)的同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，從而引發(fā)組織損傷和疾病的發(fā)生〔9〕。也有研究報(bào)道，PM2.5能夠刺激機(jī)體內(nèi)的免疫分子，通過(guò)刺激Th2細(xì)胞因子表達(dá)，引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)〔10,11〕。

近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析被廣泛應(yīng)用于疾病的研究中，轉(zhuǎn)錄組是細(xì)胞在特定狀態(tài)下所有RNA的總和，其中除mRNA外，均為非編碼RNA〔12〕。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析能夠捕獲編碼RNA和非編碼RNA，并能夠量化細(xì)胞、組織乃至整個(gè)機(jī)體中基因表達(dá)的異質(zhì)性，為基因的功能性研究提供參考〔13〕。所以利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析能夠快速準(zhǔn)確地找到與正常組織相比差異性表達(dá)的基因并進(jìn)行分析〔14〕。

本研究利用小鼠模型，將處理的PM2.5硅膠顆粒摻雜到小鼠飼料中，通過(guò)飼喂方式使PM2.5直達(dá)腸道，取不同時(shí)期小鼠的大腸黏膜組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從基因表達(dá)水平探究PM2.5對(duì)小鼠腸道疾病發(fā)生的影響。

1 材料和方法

1.1樣品的收集與處理 收集直徑≤2.5 μm的硅膠顆粒，置于北京室外頂樓1個(gè)月后回收。BALB/c品系小鼠6～8周齡，18～20 g，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C1、C2組)和實(shí)驗(yàn)組(P1、P2組)。對(duì)照組采用正常飲食，實(shí)驗(yàn)組在食物中混入處理的PM2.5硅膠顆粒(每天18 μg/g)。C1和P1組喂食10 d，C2和P2組喂食30 d，每組取3只，取其腸黏膜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的制備與上機(jī)測(cè)序 使用NEBNext RNA 超快速文庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，主要步驟如下：①mRNA 分離和片段化；②第一鏈 cDNA 合成；③第二鏈 cDNA 合成；④純化雙鏈cDNA；⑤末端修復(fù)；⑥連接接頭；⑦片段篩選；⑧文庫(kù)富集；⑨文庫(kù)純化；⑩文庫(kù)質(zhì)檢；使用 Qubit Fluorometer檢測(cè)文庫(kù) DNA 質(zhì)量濃度；使用 Qseq100 DNA Analyzer 檢測(cè)文庫(kù) DNA 長(zhǎng)度分布；使用 KAPA Library Quantification Kit 對(duì)文庫(kù) DNA 的摩爾濃度進(jìn)行定量。

上機(jī)測(cè)序(Sequencing)將文庫(kù)混合、變性后，加入到 Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量并行測(cè)序，具體操作參考使用說(shuō)明書(shū)。測(cè)序時(shí)，對(duì)文庫(kù)兩端分別進(jìn)行測(cè)序，因此每個(gè)樣本會(huì)生成測(cè)序片段1和測(cè)序片段2兩個(gè)數(shù)據(jù)文件。

1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析 ①將高通量測(cè)序的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。②參考基因組比對(duì)：把高質(zhì)量數(shù)據(jù)與指定的參考基因組比對(duì)，計(jì)算測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)效率，評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的飽和度和基因的覆蓋度。測(cè)序的飽和度是測(cè)序量與檢測(cè)到基因數(shù)量的關(guān)系，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)到的基因數(shù)目與測(cè)序數(shù)據(jù)量呈正相關(guān)性，但隨著測(cè)序量的增加，檢測(cè)到的基因數(shù)目會(huì)趨于一個(gè)穩(wěn)定值。在飽和度的分析結(jié)果中，用檢測(cè)到的剪接數(shù)來(lái)評(píng)估?；蚋采w度分析使用RSeQC分析比對(duì)測(cè)序片段在各基因上的位置分布，模擬 RNA 片段化結(jié)果，檢驗(yàn) RNA 片段化的隨機(jī)性。

1.4基因差異表達(dá)的分析 在不同樣本分組中篩選差異基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析及火山圖等可視化展示，對(duì)差異基因進(jìn)行 GO/KEGG 功能注釋及功能富集分析，KEGG信號(hào)通路分析能夠更好地了解蛋白的功能注釋及基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的生物學(xué)作用〔15〕，發(fā)掘差異基因差異化表達(dá)的功能和調(diào)控關(guān)系，采用F檢驗(yàn)。

1.5RT-PCR 對(duì)4組小鼠轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，挑選其中差異表達(dá)且富集到炎癥相關(guān)信號(hào)通路上的基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，選用GAPDH為內(nèi)參基因，驗(yàn)證基因引物為CD3e正向:5′-ACGATGCCGAGAACATTGAA-3′，反向:5′-TGGGTTGGGAACAGGTGGTG-3′；CD4正向:5′-CAGATTCCCAACCAACAAG-3′，反向:5′-AACCACTGACAACTTTACCCT-3′；Lat正向:5′-TCATCAAGCCACCTCAAATAA-3′，反向:5′-GAGAAGGCACTGTCTCCAAG-3′;Lcp2正向:5′-CCACAGCCGTCACTACCTT-3′,反向:5′-AGCGGATTTGGATGTTGTAAACT-3′;Ptprc正向:5′-TCATCGCCAG-CATCTATCC-3′，反向:5′-AGTCTGCGTTGTCCCACAT-3′;Syk正向:5′-CTCTGGCAGCTAGTGGAACA-3′，反向:5′-TTGGGAAGGAGTAGGATTTGA-3′;Vav1正向:5′-CTAACAATGGCCGATTCAC-3′，反向:5′-TTTGAGGTCGTAAGAGTCCC-3′,Zap70正向:5′-GCCTGCGTGATGCTATGGT-3′，反向:5′-CCTTCAAGCGGTAAATTAGTCC-3′;GAPDH正向:5′-GTGGCAAAGTGGAGATTGTT-3′，反向:5′-TCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 基因覆蓋度分析使用RSeQC分析，用Goseq軟件做富集，并應(yīng)用FDR進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估 共得到原始測(cè)序片段502.298 M，原始?jí)A基數(shù)75.346 G，過(guò)濾后C1、C2、P1、P2組分別得到123.278 M、124.489 M、102.584 M、89.417 M過(guò)濾后測(cè)序片段。不同喂食時(shí)期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組能比對(duì)到小鼠參考基因組上的測(cè)序片段平均比例為84.69%，其中比對(duì)到唯一位置的測(cè)序片段的平均比例為76.26%，見(jiàn)表1。

表1 不同喂食條件下小鼠轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與參考基因組比對(duì)情況(n=3)

測(cè)序飽和度曲線(圖1A)可以看出，隨著測(cè)序片段數(shù)量的增加，檢測(cè)到的剪接的數(shù)量逐漸增加，并趨于穩(wěn)定，測(cè)序的數(shù)據(jù)量達(dá)到分析要求。測(cè)序片段在基因 5′端到 3′端分布相對(duì)均勻，滿足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的要求，見(jiàn)圖1B。

2.2差異表達(dá)基因 C1組與P1組共353個(gè)差異基因，其中319個(gè)處于下調(diào)水平，34個(gè)處于上調(diào)水平。C2組與P2組共1 018個(gè)差異基因，其中437個(gè)處于下調(diào)水平，581個(gè)處于上調(diào)水平。其中共同差異基因共171個(gè)。

2.3差異基因GO富集分析 C1組與P1組的353個(gè)差異基因富集到GO數(shù)據(jù)庫(kù)3大類(生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能)的38個(gè)類別中(圖2)，與C1組相比，P1組小鼠的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，很多基因的表達(dá)量處于下調(diào)狀態(tài)，這說(shuō)明短時(shí)間內(nèi)接觸PM2.5硅膠顆粒能夠引起機(jī)體內(nèi)一定程度的基因表達(dá)異常。C2組與P2組的1 018個(gè)差異基因富集到GO數(shù)據(jù)庫(kù)3大類的43個(gè)類別中(圖3)，轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與C2組相比，P2組在生物過(guò)程中的免疫過(guò)程、細(xì)胞定位、代謝過(guò)程及細(xì)胞組分中的細(xì)胞、細(xì)胞膜部分基因表達(dá)情況有顯著上調(diào)，提示在短期接觸PM2.5硅膠顆粒的時(shí)候，機(jī)體內(nèi)的部分基因會(huì)出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，長(zhǎng)時(shí)間接觸PM2.5硅膠顆粒后，機(jī)體內(nèi)相關(guān)的炎癥基因與疾病相關(guān)基因的表達(dá)量都會(huì)有明顯上調(diào)，說(shuō)明PM2.5硅膠顆粒在體內(nèi)的積累是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

圖2 C1 vs P1組差異表達(dá)基因GO富集分析

圖3 C2 vs P2組差異表達(dá)基因GO富集分析

2.4KEGG差異基因富集分析 C1組與P1組和C2組與P2組中共同的差異基因共富集到22條顯著性差異的代謝途徑，見(jiàn)表2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，C1組與P1組和C2組與P2組中共同的差異基因富集到的有顯著性差異KEGG通路中，其大部分信號(hào)通路都與炎癥發(fā)生和疾病相關(guān)，說(shuō)明在P2組中其炎癥與疾病相關(guān)的信號(hào)通路被顯著性激活。

表2 C1組與P1組中下調(diào)、C2組與P2組中上調(diào)的共同差異表達(dá)基因

2.5PM2.5喂食過(guò)的小鼠體內(nèi)其炎癥信號(hào)通路的相關(guān)基因上調(diào) 見(jiàn)圖4。

圖4 炎癥相關(guān)基因的RT-PCR

通過(guò)KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，喂食PM2.5硅膠顆粒30 d的小鼠大腸黏膜組織中的炎癥相關(guān)和疾病相關(guān)的信號(hào)通路被顯著激活，為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，挑選了幾個(gè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路中的相關(guān)基因：Lat,Lcp2,Ptprc,Vav1,Zap70,Syk,CD3e,CD4，設(shè)計(jì)引物用GAPDH作為內(nèi)參，在RNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這些炎癥相關(guān)基因的表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相一致，在P1組中其表達(dá)量有部分下調(diào)，但在P2組，其表達(dá)量有一定程度上調(diào)，說(shuō)明在P2組中，小鼠體內(nèi)的炎癥相關(guān)基因表達(dá)量有明顯升高，激活了炎癥相關(guān)信號(hào)通路并誘發(fā)炎癥反應(yīng)。

3 討 論

研究表明，長(zhǎng)期暴露于空氣污染會(huì)促使大腦結(jié)構(gòu)的損傷，損傷中老年個(gè)體的認(rèn)知功能〔16〕，不僅如此，環(huán)境污染的程度與兒童支氣管炎癥狀的加劇有關(guān)，表明減少空氣污染有益于哮喘的控制〔17〕。PM2.5作為空氣污染中最重要的致病成分，也受到了高度重視。研究表明，PM2.5在空氣中濃度增高會(huì)增加一些疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)〔18〕，會(huì)使肺炎的發(fā)病率顯著升高，由于生物體生理結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，呼吸道與食道相通，所以當(dāng)PM2.5在吸入機(jī)體的時(shí)候，也會(huì)有一部分PM2.5進(jìn)入食道，通過(guò)食道進(jìn)入機(jī)體中，而且鑒于腸道的特殊結(jié)構(gòu)，PM2.5在到達(dá)腸道之后，能夠在此累積，本文中通過(guò)利用PM2.5硅膠顆粒喂食小鼠的實(shí)驗(yàn)方法探討了PM2.5對(duì)于腸道疾病發(fā)生的影響。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平的研究〔19〕，相較于傳統(tǒng)的基因組測(cè)序而言，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序更能體現(xiàn)基因表達(dá)的差異性，特別是基因在時(shí)間和空間表達(dá)的差異性〔20〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5會(huì)在腸道中累積，少量的PM2.5會(huì)引起基因表達(dá)的普遍下調(diào)，總體影響不明顯，但積累到一定量的時(shí)候就會(huì)激活機(jī)體免疫相關(guān)信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)并可能進(jìn)一步導(dǎo)致疾病的發(fā)生，但其具體的作用機(jī)制目前還不明確。由于很多疾病的發(fā)生是由于免疫失調(diào)導(dǎo)致的，腸道黏膜內(nèi)炎癥因子與炎癥抑制性因子的平衡失調(diào)導(dǎo)致了腸道炎癥的發(fā)生及慢性炎癥的出現(xiàn)。有研究表明，慢性黏膜炎癥和組織損傷易使炎癥性腸病患者發(fā)展為結(jié)直腸癌，且風(fēng)險(xiǎn)隨著炎癥的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度而增加〔21〕。本研究結(jié)果還說(shuō)明，長(zhǎng)期暴露于PM2.5濃度較高的環(huán)境下，不僅會(huì)導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病，也可能會(huì)引起腸道或機(jī)體內(nèi)其他組織疾病，而且會(huì)使結(jié)直腸癌的患病率大大增加。