紅景天苷促進小鼠脊髓損傷后巨噬細胞表型轉變及神經(jīng)功能修復

盧桃利 霍芳芳 翟中杰 張蓓

(1成都市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內科，四川 成都 610015；空軍軍醫(yī)大學 2第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科；3衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室)

脊髓損傷(SCI)分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷〔1〕。研究證實繼發(fā)性損傷能誘導出血、水腫、凋亡及炎癥反應，其中炎癥反應尤為重要，直接影響SCI后神經(jīng)功能的恢復〔2〕。巨噬/小膠質細胞因其特殊表型，直接影響炎癥反應過程，具體分型為：促炎(M1)表型即經(jīng)典激活型和抑炎(M2)表型，被稱為選擇激活表型〔3,4〕。M1表型細胞在脂多糖(LPS)或干擾素(INF)-γ的誘導下釋放多種促炎因子，加重炎癥反應〔5〕；M2表型細胞可能在抑炎因子白細胞介素(IL)-4，IL-13的作用下上調抑炎因子〔6〕。因此，促進M1向M2轉換，減輕SCI后的炎癥反應，減少軸突損害，促進脊髓功能恢復意義重大〔7〕。紅景天苷是從紅景天中提取出來的一種糖氧苷類化合物，具有保護心肌和抗心律失常作用〔8〕，在抗衰老〔9〕、腫瘤〔10〕及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病亦有重要作用〔11,12〕。在炎癥反應方面，紅景天苷可通過分泌抑炎因子抑制LPS誘導的炎癥反應，同時通過絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路表達促炎因子〔13〕。紅景天苷可能改善巨噬/小膠質細胞極性，發(fā)揮神經(jīng)保護作用〔14〕，但具體機制仍不清楚。本研究通過脊髓鉗夾法建立小鼠SCI模型，探討紅景天苷對SCI局部炎癥微環(huán)境尤其是巨噬/小膠質細胞表型的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 90只8周齡雌性C57BL/6小鼠，SPF級，體質量15～20 g。空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供〔動物合格證號SCXK(軍)2012-0007〕。實驗分組：SCI組(對照組)和SCI+紅景天苷治療組(紅景天苷組)，將兩組分為損傷后1、3、7、14和28 d 5個亞組，進行相關檢測。

1.2實驗試劑 紅景天苷(美國Sigma 公司)；SYBR Green實時熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)定量試劑盒(日本Takara公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國R&D 公司)；免疫熒光一抗抗體：抗-Arginase(Arg)1、抗-誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及抗-黏附分子CD11b抗體(美國Abcam公司)；熒光二抗抗體：驢抗兔488，驢抗羊555和驢抗大鼠594(美國Invitrogen 公司)。

1.3動物處理及實驗方法 暴露小鼠 T9-T11脊柱，使用椎板切除術咬除 T10 節(jié)段，用動脈夾置于T10兩側并持續(xù) 30 s，達到有效破壞小鼠皮質脊髓束，縫合肌肉層和皮膚。紅景天苷組于術后開始給予紅景天苷(20 μg/g)，1次/d，直至處死。對照組同一時間給予生理鹽水。術后適時壓迫膀胱幫助排尿。

1.4觀察及指標檢測

1.4.1行為學評分 采用雙盲法對兩組實驗小鼠在SCI模型制作前及損傷后1、3、7、14和28 d進行神經(jīng)功能評分(BNS)。具體標準主要從行走步態(tài)、肢體承重及關節(jié)活動方面進行評估。

1.4.2免疫熒光染色分析M1和M2細胞 取損傷組織標本行冰凍切片包埋劑(OCT)包埋，制作冰凍切片(n=4)，經(jīng)0.3%Triton破膜及5%牛血清蛋白(BSA)封閉處理后，使用熒光一抗抗體鼠抗-iNOS(1∶100;M1 Marker)與免抗-黏附分子CD11b(1∶200;巨噬/小膠質細胞Marker)結合，放置 4℃冰箱過夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后與熒光二抗(1∶1 000)結合行Alex-flour 標記，室溫孵育，漂洗后4′6-二脒基-二苯基吲哚(DAPI)封片；同樣方法使用熒光一抗羊抗-Arg-1(1∶100;M2 Marker)，標記M2表型細胞。最后激光共聚焦熒光顯微鏡照片及采圖。計數(shù)iNOS/CD11b標記的M1表型細胞數(shù)及Arg1+/CD11b標記的M2表型細胞數(shù)。

1.4.3RT-PCR檢測M1和M2 表型表達 各時間點分別取損傷中心組織，通過Trizol法提取總RNA，檢測RNA濃度后轉錄為cDNA可進行RT-PCR反應。引物設計：iNOS引物：上游：CCCTTCAATGGTTGGTACATGG，下游：ACATTGATCTCCGTGAC-AG CC;CD86引物：上游：TTTGGACACCCAGATGTTTCAG，下游：GTCTTCCTTGAGCACCTGGATC;Arg1引物：上游CAGAAGAATGGAAGAGTCAG，下游：CAGATATGCAGGGAGTCACC；幾丁質酶蛋白3(Ym1)：引物上游：TGGAGGATGGAAGTTTGGAC,下游：AATGATTCCTGCTCCTGTGG。PCR循環(huán)條件：95℃ 30 s，75℃60 s，60℃30 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s后4℃保存。

1.4.4ELISA法檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6、IL-1β、IL-10蛋白表達 各時間點取損傷中心組織，勻漿充分，離心，收集上清，-80℃冷藏備用。按說明書操作，測量各孔的吸光度(OD值)。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行兩因素方差分析、重復測量方差分析。

2 結 果

2.1BNS SCI后兩組各時間點均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損。隨著時間推移兩組神經(jīng)功能有所恢復，但紅景天苷組在3、7、14、28 d BNS評分明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

2.2免疫熒光標記法 與對照組相比，術后3、7、14 d時紅景天苷組M1表型細胞(iNOS/CD11b)的比例顯著降低(P<0.01)，M2表型細胞(Arg1/CD11b)的比例顯著提高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

2.3RT-PCR檢測結果 紅景天苷組術后1、3、7 d的M1表型細胞iNOS和術后3、7、14 d CD86 mRNA的表達較對照組顯著減少，而術后1、3、7 d M2表型細胞Arg1、YM-1 mRNA的表達較對照組顯著增加(P<0.05，P<0.01)，見圖1、表3、表4，圖2。

表1 SCI后兩組各時間點BNS評分比較分,n=15)

與對照組比較：1)P<0.01；表2同

表2 兩組各時間點M1表型(iNOS/CD11b)、M2表型(Arg1/CD11b)巨噬細胞比例

圖1 SCI后第7天兩組損傷節(jié)段M1表型巨噬細胞免疫熒光染色(標尺=200 μm)

組別iNOS mRNA術后1 d 術后 3 d術后7 d術后14 dCD86 mRNA術后1 d 術后3 d術后7 d 術后14 d對照組7.34±1.8712.45±1.217.57±1.59 2.06±1.171.73±0.62 4.73±0.50 12.02±2.20 7.00±1.20紅景天苷組3.72±1.091)5.36±1.002)2.40±0.612)1.37±0.471.08±0.28 2.24±0.781)3.64±0.832)1.89±0.372)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表4 兩組各時間點M2表型(Arg1、YM-1)巨噬細胞mRNA表達

圖2 SCI后第7天兩組損傷節(jié)段M2表型巨噬細胞免疫熒光染色(標尺=200 μm)

2.4兩組炎癥因子的表達 與對照組比較，紅景天苷組抑制促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(P<0.05,P<0.01)，在損傷后7 d尤為明顯；同時促進抑炎因子IL-10的表達(P<0.05,P<0.01)。見表5。

表5 兩組各時間點局部促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10表達水平

3 討 論

SCI后對機體運動和感覺造成極大損傷，給社會和家庭帶來負擔。如何減輕緩解SCI后的炎癥及神經(jīng)功能缺損尤為重要。繼發(fā)性SCI后早期M1巨噬細胞較M2巨噬細胞比例高，釋放促炎因子，加重炎癥反應；M2能夠促進抑炎因子的釋放，誘導Th1向Th2的分化，同時這些抑炎因子也能進一步促進局部巨噬細胞向M2分化〔15,16〕。SCI后局部給予腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)能上調IL-10和IL-13，下調IL-1β和,TNF-α,促進M1向M2表型轉變，在SCI后神經(jīng)功能恢復發(fā)揮重要作用〔17〕。SCI后M1巨噬細胞炎性反應迅速且持久，而M2巨噬細胞的保護作用緩慢又短暫〔18〕，如何維持M1∶M2比例水平，促進SCI后的神經(jīng)功能恢復，將是目前基礎與臨床研究的熱點。

紅景天苷在SCI后凋亡等系列反應中發(fā)揮作用，是否參與SCI巨噬細胞極性目前報道較少。Liu等〔14〕試驗證實紅景天苷能促進腦缺血后小鼠體內M2巨噬細胞極性表達，可能與紅景天苷下調小膠質瘤細胞(BV2細胞)，抑制M1小膠質細胞分泌炎癥因子有關。而小膠質細胞主要參與SCI后的炎癥反應。Wang等〔19〕的體外實驗報道紅景天苷能抑制M1小膠質細胞極性表達，上調M2小膠質細胞表型Arg1的表達，表明紅景天苷通過調節(jié)M1和M2細胞表達比例參與炎癥反應。本實驗發(fā)現(xiàn)，紅景天苷下調SCI后損傷局部iNOS/CD86/CD11b(M1表型細胞)表達，促進Arg1/YM-1/CD11b(M2表型細胞)的表達，說明紅景天苷參與SCI后小膠質/巨噬細胞極性向M2分化。

既往實驗顯示，SCI后M1小膠質/巨噬細胞分泌促炎因子，M2小膠質/巨噬細胞釋放抑炎因子，而炎癥因子在參與炎癥級聯(lián)反應的同時反過來影響巨噬小膠質極性分化〔6,20〕。其中促炎因子尤其是TNF-α、IL-6和IL-1β發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。因此抑制M1小膠質/巨噬細胞極性，能抑制炎癥因子釋放，可能發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本實驗也發(fā)現(xiàn)紅景天苷能抑制促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達，上調抑炎因子IL-10的表達，與紅景天苷抑制M1巨噬/小膠質細胞極性，促進向M2小膠質/巨噬細胞分化有關。且本實驗還發(fā)現(xiàn)SCI早期，抑炎因子占優(yōu)勢，在SCI 3 d、7 d紅景天苷主要以抑制炎性因子表達為主要表現(xiàn)，在損傷后期14 d甚至更長時間，紅景天苷主要促進抑炎因子的表達，推測紅景天苷可能在SCI早期以抑制M1巨噬細胞參與的炎癥反應為主，而后期通過上調抑炎因子延長發(fā)揮M2巨噬細胞的神經(jīng)修復作用，具體機制仍需進一步研究。

炎癥反應在SCI后神經(jīng)功能恢復中發(fā)揮重要作用。使用IL-6單克隆抗體抑制SCI后IL-6的過表達，能降低iNOS、CD26/32陽性細胞表達，促進M2表型因子Arg1及CD206的表達，證明抑制炎癥因子IL-6有利于向M2巨噬細胞表型轉變，降低炎癥反應，促進SCI后功能恢復〔21〕。紅景天苷在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，推測可能與紅景天苷參與炎癥反應有關。紅景天苷能下調促炎因子表達，促進M1巨噬細胞向M2巨噬細胞轉變，減少局灶腦缺血后的梗死面積及改善運動功能恢復〔14〕。本實驗也發(fā)現(xiàn)紅景天苷能促進SCI后運動功能恢復，可能與紅景天苷促進巨噬細胞極性有關，這與Wang等〔19〕試驗一致。除此之外紅景天苷還能促進髓鞘再生，抑制自體吞噬〔22〕、凋亡〔23〕及氧化應激〔24〕等，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上，紅景天苷可能通過影響巨噬細胞極性改變，抑制炎癥反應，改善SCI后神經(jīng)功能。巨噬細胞極性轉化涉及多因子、多通路，具體機制仍需進一步研究。