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    燈盞乙素調(diào)節(jié)ATP敏感性鉀通道對(duì)抗β-淀粉樣蛋白的毒性作用

    2019-07-01 03:52:26王寧慧伍棋于燕妮郭莉莉
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2019年12期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    王寧慧 伍棋 于燕妮 郭莉莉

    (1貴州醫(yī)科大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550004;2貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院)

    阿爾茨海默病(AD)的病理機(jī)制與β-淀粉樣蛋白(Aβ)的多個(gè)神經(jīng)毒性機(jī)制密切相關(guān),這些毒性機(jī)制之間相互影響,互為調(diào)節(jié),形成一個(gè)復(fù)雜的多因素循環(huán)作用,貫穿在整個(gè)疾病進(jìn)程中。Aβ作為疾病致病分子的認(rèn)識(shí)多年來(lái)得到公認(rèn),雖然針對(duì)Aβ設(shè)計(jì)的靶向臨床藥物并未取得治療上的突破,然而研究者們卻得到了在治療上應(yīng)針對(duì)Aβ毒性而非單純針對(duì)Aβ本身的重大提示〔1,2〕。致力于多個(gè)靶點(diǎn)的毒性對(duì)抗,降低Aβ神經(jīng)毒性以期延緩AD進(jìn)程,仍然是AD的主要治療策略之一。課題組利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)獲取了AD雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腦組織中Aβ毒性相關(guān)的差異蛋白點(diǎn),同時(shí)觀察到燈盞乙素(Scu)主要調(diào)節(jié)了其中12個(gè)差異靶蛋白點(diǎn)的療效,包括ATP敏感性鉀通道(KATP)蛋白〔3〕。分化成熟的人源性神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞具有神經(jīng)元的形態(tài)和特性,并表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物,往往被用來(lái)制作神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞模型〔4〕,本實(shí)驗(yàn)利用該細(xì)胞株制作Aβ毒性誘導(dǎo)的反映AD病程的細(xì)胞模型,進(jìn)一步驗(yàn)證并探討Scu介導(dǎo)KATP路徑對(duì)抗Aβ神經(jīng)毒性的療效及作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)藥物及細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)Scu為淺棕色粉末(批號(hào):ZL20161012037,純度98%),由南京澤朗生物醫(yī)藥科技公司提供;Aβ1~42寡聚體購(gòu)自Sigma公司(編號(hào):A9810);二氮嗪(DZ)購(gòu)自Sigma公司(編號(hào):D9035);SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞生物研究所(編號(hào):KCB2006107YJ)。

    1.2主要試劑與儀器 CCK8試劑購(gòu)自同仁公司(日本);多克隆兔抗Kir6.1購(gòu)自GenTex公司(美國(guó));多克隆兔抗Kir6.2、SUR1、SUR2購(gòu)自Abcam公司(美國(guó));β-actin抗體購(gòu)自CST公司(美國(guó));Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;DiBAC4(3)熒光探針購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)和ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Couler公司);蛋白質(zhì)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

    1.3方法

    1.3.1藥物制備 Aβ1~42用六氟異丙醇(HFIP)進(jìn)行充分溶解并分裝,通風(fēng)櫥過(guò)夜風(fēng)干,-80℃保存待用,使用前加二甲基亞砜(DMSO)溶解, 用不含酚紅的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成每管10 μmol/L,4 ℃冰箱放置24 h,離心后取上清使用〔5〕;Scu和DZ 在使用前精確稱量分裝,再用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液充分稀釋,0.22 μm微孔注射濾器過(guò)濾后使用。

    1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)液為DMEM高糖培養(yǎng)基,添加12%胎牛血清,1%雙抗,培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2,將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板中,分為對(duì)照組、Scu處理組、Aβ處理組、Scu+Aβ處理組、DZ+Aβ處理組。對(duì)照組不加藥物處理;Scu處理組加入Scu(10 μmol/L)培養(yǎng)48 h;Aβ處理組加入Aβ1~42(1 μmol/L)培養(yǎng)24 h;Scu+Aβ處理組、DZ+Aβ處理組分別加入Scu(10 μmol/L)、DZ培養(yǎng)24 h,再加入Aβ1~42(1 μmol/L)培養(yǎng)24 h。

    1.3.3CCK-8法篩選藥物濃度 將細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板,每孔100 μl,單加磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對(duì)照,細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同濃度DZ(0、100、200、250、500、1 000、2 000 μmol/L)的加藥處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑,CCK-8試劑用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液以1∶10 的比例稀釋后,每孔100 μl均勻加入,放置培養(yǎng)箱孵3 h后用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD值,根據(jù)公式存活率=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)計(jì)算各組細(xì)胞存活率。Aβ及Scu的濃度同之前的檢測(cè)方法和結(jié)果〔6〕。

    1.3.4生物化學(xué)方法檢測(cè)各組ATP含量 將細(xì)胞接種于6孔板中,24 h貼壁后進(jìn)行分組處理。各組細(xì)胞分別加入200 μl/孔的裂解液裂解細(xì)胞,4℃ 12 000 r/min離心5 min,取上清待用。將100 μl/孔 ATP檢測(cè)工作液加入96孔板中,室溫放置3~5 min,再加入上述上清或標(biāo)準(zhǔn)品,多功能酶標(biāo)儀(化學(xué)發(fā)光)檢測(cè),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ATP含量。

    1.3.5Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞KATP通道亞基內(nèi)向整流鉀通道(Kir)6.1、Kir6.2、磺酰脲受體(SUR)1、SUR2的蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞,加入蛋白裂解液,4℃裂解1 h,4 ℃ 12 000 r/min離心20 min,取上清并進(jìn)行BCA蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)于PVDF膜上,各指標(biāo)一抗和二抗孵育后曝光顯影。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照,用ImageJ 軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析,結(jié)果以各指標(biāo)條帶與β-actin條帶灰度的比值作為各指標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    1.3.6DiBAC4(3)熒光探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞膜電位 將細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板中,24 h細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理后分別加入180 μl的5 μmol/L DiBAC4(3)的檢測(cè)用緩沖液,在5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min,孵育結(jié)束后再加入20 μl的5 μmol/L DiBAC4(3)的檢測(cè)用緩沖液,用多功能酶標(biāo)儀(激發(fā)光488 nm,發(fā)射光517 nm,孵育溫度37℃)觀察各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化。

    1.3.7JC-1熒光探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位 將細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板中,24 h細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理。各組細(xì)胞分別加入50 μl/孔細(xì)胞培養(yǎng)液和50 μl/孔JC-1染色工作液,充分混勻,細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃孵育20 min,孵育結(jié)束后吸除上清,用JC-1染色緩沖液洗滌2次,最后加入100 μl/孔細(xì)胞培養(yǎng)液,多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)JC-1聚合體(激發(fā)光525 nm,發(fā)射光590 nm)和JC-1單體(激發(fā)光490 nm,發(fā)射光530 nm)熒光值,線粒體膜電位用JC-1單體熒光值/JC-1聚合體熒光值作為相對(duì)比值進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)。

    1.3.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞接種于6孔板中,24 h貼壁后進(jìn)行分組處理。用不含EDTA的胰酶(200 μl/孔)消化收集細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞兩次后,用500 μl上樣緩沖液懸浮細(xì)胞,再依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶混勻,室溫避光放置15 min,在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè),利用Flow-Jo流式分析軟件,計(jì)算細(xì)胞總凋亡率。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和秩和檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1不同濃度DZ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性的影響 濃度為0、100、200、500、1 000、2 000 μmol/L的DZ作用于SH-SY5Y細(xì)胞48 h后的細(xì)胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(103.47±8.16)%、(92.36±3.38)%、(65.32±3.75)%、(48.81±4.26)%、(30.31±5.54)%。0~200 μmol/L DZ作用于細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯變化,500~2 000 μmol/L作用后細(xì)胞的增殖活性呈不同程度的下降,毒性作用呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),選擇200 μmol/L作為DZ實(shí)驗(yàn)用濃度。

    2.2各組細(xì)胞ATP含量 與對(duì)照組〔(9.57±0.62)nmol/mg〕和Scu處理組〔(9.86±1.18)nmol/mg〕相比,Aβ處理組〔(6.84±0.68)nmol/mg〕ATP含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Scu干預(yù)后〔Scu+Aβ處理組(8.78±0.73)nmol/mg〕,ATP含量有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DZ干預(yù)后〔DZ+Aβ處理組(7.22±0.30)nmol/mg〕,ATP含量也有所升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.3Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2的蛋白表達(dá) 與對(duì)照組和Scu處理組相比,Aβ處理組Kir6.1、SUR2的蛋白表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Kir6.2、SUR1的表達(dá)無(wú)明顯變化;Scu干預(yù)后,Kir6.1、SUR2的蛋白表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),未見(jiàn)Kir6.2、SUR1的表達(dá)變化。DZ+Aβ處理組的表現(xiàn)與Scu+Aβ處理組基本一致。見(jiàn)表1,圖1。

    1~5:對(duì)照組;Scu處理組;Aβ處理組;Scu+Aβ處理組;DZ+Aβ處理組圖1 各組細(xì)胞中Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2蛋白表達(dá)水平

    組別Kir6.1Kir6.2SUR1SUR2對(duì)照組0.65±0.060.86±0.060.53±0.060.68±0.05Scu 處理組0.64±0.140.86±0.160.54±0.090.66±0.12Aβ處理組1.09±0.231)0.84±0.060.55±0.031.02±0.081)Scu+Aβ處理組0.74±0.122)0.88±0.140.56±0.050.76±0.072)DZ+Aβ處理組0.67±0.162)0.85±0.120.57±0.050.77±0.102)

    與對(duì)照組比較:1)P<0.01;與Aβ處理組比較:2)P<0.01

    2.4各組細(xì)胞細(xì)胞膜電位變化 與對(duì)照組(6.86±0.05)和Scu處理組(6.79±0.05)相比,Aβ處理組(7.38±0.14)的熒光值有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表示細(xì)胞膜膜電位升高,呈現(xiàn)去極化現(xiàn)象;而與Aβ處理相比,Scu+Aβ處理組(6.86±0.20)的熒光值趨向于正常,但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表示膜電位的去極化現(xiàn)象有所改善。DZ+Aβ處理組(6.90±0.33)的表現(xiàn)與Scu+Aβ處理組基本一致。

    2.5各組細(xì)胞線粒體膜電位變化 與對(duì)照組(1.03±0.07)和Scu處理組(1.03±0.04)相比,Aβ處理組(1.43±0.02)的熒光值有所升高,但差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表示細(xì)胞膜膜電位升高,呈現(xiàn)去極化現(xiàn)象;而與Aβ處理相比,Scu+Aβ處理組(1.23±0.05)的熒光值趨向于正常,但差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表示膜電位的去極化現(xiàn)象有所改善。DZ+Aβ處理組(1.22±0.04)的表現(xiàn)與Scu+Aβ處理組基本一致。

    2.6各組細(xì)胞總凋亡率 與對(duì)照組(4.18%±0.63%)和Scu處理組(4.25%±0.42%)相比,Aβ處理組(17.58%±0.48%)細(xì)胞總凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Scu干預(yù)后,細(xì)胞總凋亡率(11.23%±0.84%)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。DZ+Aβ處理組(9.67%±1.03%)的表現(xiàn)與Scu+Aβ處理組基本一致。

    3 討 論

    KATP是一種與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)的配體門控鉀通道,受腺苷酸的調(diào)節(jié)直接將細(xì)胞的代謝狀態(tài)與電活動(dòng)相耦聯(lián),在神經(jīng)系統(tǒng)中起神經(jīng)元保護(hù)作用〔7〕。細(xì)胞內(nèi)ATP是KATP通道的主要調(diào)節(jié)劑,通道的開(kāi)閉直接受其調(diào)控,正常細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ATP濃度約為10 nmol/mg蛋白,此時(shí)KATP處于穩(wěn)定狀態(tài),當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境刺激時(shí),胞質(zhì)內(nèi)ATP濃度發(fā)生適應(yīng)性下降,觸發(fā)KATP開(kāi)放。細(xì)胞膜上的KATP開(kāi)放時(shí),K+外流,細(xì)胞膜超極化,抑制細(xì)胞膜上電壓依賴性離子通道的開(kāi)放,比如抑制電壓依賴性鈣離子通道,可減少鈣內(nèi)流,減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載誘發(fā)的凋亡,同時(shí)也能減少動(dòng)作電位的發(fā)生,減少能量消耗;線粒體膜上的KATP開(kāi)放時(shí),線粒體膜超極化,可維持線粒體膜電位,穩(wěn)定線粒體體功能,抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開(kāi)放,減少氧自由基和凋亡啟動(dòng)因子釋放,進(jìn)而減少氧化應(yīng)激損傷和凋亡發(fā)生〔8〕。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Aβ的毒性刺激使細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度明顯下降,細(xì)胞膜和線粒體膜電位呈現(xiàn)去極化改變,表明Aβ刺激了ATP調(diào)節(jié)下的KATP開(kāi)放,神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自主調(diào)節(jié)的生物學(xué)行為,然而,細(xì)胞凋亡率的增加,代表這種適應(yīng)性反應(yīng)遠(yuǎn)不足以抵消Aβ造成的細(xì)胞損傷。

    KATP主要分布在神經(jīng)元、胰腺β細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜和線粒體膜表面,由4種Kir和4種SUR組成,Kir家族形成通道孔,Kir6為ATP敏感,目前確定的有Kir6.1和Kir6.2兩種亞基,SUR為ATP結(jié)合蛋白的“超家族”,構(gòu)成通道調(diào)控元件,包括SUR1和SUR2兩種亞基。研究發(fā)現(xiàn),KATP通道亞基在腦內(nèi)廣泛表達(dá)(包括在與認(rèn)知能力密切相關(guān)的海馬區(qū)域,海馬區(qū)主要以Kir6亞基表達(dá)為主)〔9〕,我們同樣觀察到實(shí)驗(yàn)用神經(jīng)元細(xì)胞中均呈現(xiàn)出Kir6.1、Kir6.2、SUR1和SUR2的蛋白表達(dá),且Aβ的處理引起了Kir6.1和SUR2的蛋白表達(dá)上調(diào),對(duì)Kir6.2和SUR1的蛋白表達(dá)并無(wú)影響,代表Aβ觸發(fā)的KATP通道開(kāi)放選擇性作用于Kir6.1/SUR2亞基。與此同時(shí),我們觀察到在Scu干預(yù)后,Aβ刺激下細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度水平與細(xì)胞膜和線粒體膜電位的變化趨向于正常,Kir6.1和SUR2的蛋白表達(dá)下調(diào),細(xì)胞總凋亡率明顯下降,顯示出Scu可能通過(guò)調(diào)節(jié)KATP通道蛋白Kir6.1/SUR2亞基的表達(dá),或者是降低KATP通道對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP的敏感性而激活了通道開(kāi)放,在Aβ的毒性影響下發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

    KATP通道現(xiàn)已成為包括神經(jīng)變性性疾病在內(nèi)的多種疾病的治療靶點(diǎn),多種KATP通道開(kāi)放劑(KCOs)被應(yīng)用于臨床并取得較好療效,不同類型的KCOs通過(guò)不同方式選擇性作用于KATP通道蛋白〔10〕。二氮嗪(DZ)作為KCOs的一種類型被證實(shí)可以用來(lái)延緩Aβ毒性導(dǎo)致的細(xì)胞損傷〔11〕,有研究顯示其可激活心肌細(xì)胞膜上的Kir6.1/SUR2亞型KATP通道來(lái)介導(dǎo)對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù),實(shí)驗(yàn)中DZ對(duì)ATP濃度的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與其主要是增加細(xì)胞內(nèi)二磷酸腺苷(ADP)的濃度有關(guān)。我們觀察到Scu發(fā)揮了與DZ基本相一致的作用,提示Scu存在作為KCOs應(yīng)用來(lái)降低Aβ毒性的可能。

    課題組在同期實(shí)驗(yàn)中觀察到,Scu能夠通過(guò)干預(yù)APP代謝的β分泌酶途徑來(lái)抑制Aβ的生成〔12〕;能夠通過(guò)對(duì)IP3R-Ca2+途徑的調(diào)控和介導(dǎo)MPTP的開(kāi)放來(lái)抑制Aβ毒性所致的細(xì)胞凋亡〔13〕;能夠調(diào)節(jié)Aβ毒性所致神經(jīng)元中組蛋白H2A、H2B、H3的表達(dá),通過(guò)改變AD表觀遺傳的信息異常來(lái)發(fā)揮預(yù)防和治療作用〔14〕等。綜上所述,我們推測(cè)其還可能通過(guò)調(diào)控ATP介導(dǎo)的KATP通道開(kāi)放來(lái)抑制Aβ毒性所致的細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)為藥物針對(duì)Aβ毒性在AD治療中產(chǎn)生積極影響提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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