老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者血漿miRNA-195表達(dá)及其與側(cè)支循環(huán)形成的關(guān)系

盧輝耀 許朝祥 徐訓(xùn)發(fā)

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建 泉州 362000)

冠心病是一種不可逆的慢性病，主要是由冠狀動(dòng)脈血管動(dòng)脈粥樣硬化而引起的血管腔狹窄或阻塞〔1〕。冠狀動(dòng)脈狹窄程度相近的冠心病患者的臨床癥狀及遠(yuǎn)期預(yù)后差異較大，這可能與冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)密切相關(guān)〔2〕。冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)是心肌在長(zhǎng)期缺血缺氧的基礎(chǔ)上形成的代償機(jī)制，可起到保護(hù)心室功能的作用〔3〕。微小RNA(microRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小RNA，在多種組織中均有表達(dá)〔4〕。miRNA-195是microRNA的一個(gè)重要類型，既參與細(xì)胞缺氧的調(diào)控，也參與機(jī)體固有免疫的調(diào)節(jié)〔5〕，研究表明其與血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和分化具有相關(guān)性〔6〕，但miRNA-195與老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者側(cè)支循環(huán)的形成報(bào)道較少。本研究探討老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者血漿miRNA-195的表達(dá)及其與側(cè)支循環(huán)形成的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2014年4月至2017年10月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的68例老年冠心病患者納入老年冠心病組，入組患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查，存在左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈單支且冠狀動(dòng)脈狹窄程度達(dá)95%以上。排除合并急性心肌梗死者、冠狀動(dòng)脈心肌橋者、先天性冠狀動(dòng)脈畸形者、血液系統(tǒng)疾病者、嚴(yán)重肝腎功能不全者、有經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療史者及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)者。根據(jù)Rentrop分級(jí)將患者分為側(cè)支良好亞組(Rentrop分級(jí)≥2)32例和側(cè)支不良亞組(Rentrop分級(jí)≤1)36例。側(cè)支良好亞組男18例，女14例，年齡65～80歲，平均(71.73±6.58)歲，Gensini積分(110.96±34.72)分；側(cè)支不良亞組男21例，女15例，年齡65～80歲，平均(72.24±7.32)歲，Gensini積分(63.19±22.04)分。另將同期到福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢的72例體檢健康者納入對(duì)照組，其中男39例，女33例；年齡65～80歲，平均(71.26±6.67)歲。老年冠心病組和對(duì)照組的性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象及其家屬在參與研究前均知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2樣本采集 老年冠心病組于冠狀動(dòng)脈造影術(shù)前抽取患者空腹靜脈血5 ml；對(duì)照組于體檢當(dāng)日清晨抽取空腹靜脈血5 ml，均置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，經(jīng)離心處理后取上清液存于-20℃冰箱中待檢。

1.3試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒由美國(guó)ABI公司提供；TRIzol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司；7500型RT-PCR儀由美國(guó)ABI公司提供；分光光度計(jì)購(gòu)于Bio-Rad公司；離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.4血漿中miR-195的測(cè)定 ①總RNA提取：取2 ml血漿樣本按TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本中總RNA，0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，采用Bio-Rad檢測(cè)RNA純度及濃度，另取1 μl RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，將電泳條帶清晰者用于RT-PCR檢測(cè)。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl，于0.1 ml EP管中分別加入10×RT緩沖液1.5 μl、1 μmol/L逆轉(zhuǎn)錄特異性引物3 μl、100 mmol/L脫氧核苷酸(dNTPs) 0.15 μl、20 U/μl RNA酶抑制劑0.19 μl、50 U/μl MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μl、RNA樣品1 μl，然后加DEPC水補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 s，反應(yīng)后產(chǎn)物置于-20℃保存。miR-195逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-TCTCACTGTGTCCGTAAAGTCGGCAACATTGCCGTTTCGCACTC-3′；U6逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CTCTGCAAACGTGCGTTTGTCCA-3′。③RT-PCR反應(yīng)：按照PCR試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為20 μl，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1 μl、TaqMan GEx MASTER Mix 10 μl、引物1 μl、雙蒸水8 μl。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT方法計(jì)算miR-195表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參，ΔCt值=miR-195Ct值-U6Ct值。miR-195引物序列：正向5′-TCTCACCATGCAAATGCGGGTCATTTAGGA-3′，反向5′-GGTAGTGCAGGTAGTG-3′；U6引物序列：正向5′-CCTGCGGCTTCTGACCT-3′，反向5′-CGAACCTTAAACGTGCTTGT-3′。

1.5血漿中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的測(cè)定 取2 ml血漿樣本應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)患者血清中VEGF的濃度，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔(加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μl)、待測(cè)樣品孔(先加入樣品稀釋液40 μl，再加入待測(cè)樣品10 μl)及空白孔(不加樣品及酶標(biāo)試劑)，封板后常溫(37℃)孵育30 min，然后重復(fù)洗滌5次，再向標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔各加入50 μl酶標(biāo)試劑，然后在進(jìn)行常溫孵育及洗滌(步驟同上)，然后再加入顯色劑、終止液，測(cè)量三個(gè)孔的吸光度，并于加入終止液15 min內(nèi)測(cè)定VEGF水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.5軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)，Pearson直線相關(guān)分析，Logistic回歸分析，采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血漿miRNA-195水平對(duì)冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成的辨別能力。

2 結(jié) 果

2.1兩組血漿中miRNA-195及VEGF水平比較 老年冠心病組血漿中miRNA-195及VEGF表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(t=5.978、4.871，均P=0.000)，其中側(cè)支不良亞組明顯低于側(cè)支良好亞組和對(duì)照組(t=8.662、11.204，P=0.000；t=7.961、10.812，均P=0.000)，見(jiàn)表1。

表1 兩組血漿中miRNA-195及VEGF水平比較

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與側(cè)支良好亞組比較:2)P<0.05

2.2血漿miRNA-195表達(dá)與老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者側(cè)支循環(huán)的相關(guān)分析 血漿miRNA-195表達(dá)水平與老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者側(cè)支循環(huán)呈正相關(guān)(r=0.615，P=0.003)，側(cè)支循環(huán)良好者的血漿miRNA-195水平相對(duì)較高。

2.3影響老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者側(cè)支循環(huán)的因素分析 多因素Logistic回歸分析提示，血漿miRNA-195水平和Gensini積分是影響老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者側(cè)支循環(huán)的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

2.4血漿miRNA-195表達(dá)對(duì)冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成的辨別能力分析 以血漿miRNA-195表達(dá)水平作為檢驗(yàn)變量，以是否形成冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)為狀態(tài)變量制作ROC曲線，由ROC曲線可知，血漿miRNA-195判斷老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者側(cè)支循環(huán)形成的靈敏度為83.28%，特異度為94.75%，見(jiàn)圖1。

表2 影響老年冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者側(cè)支循環(huán)的因素分析

圖1 血漿miRNA-195相對(duì)表達(dá)量的ROC曲線圖

3 討 論

miRNA廣泛存在于真核生物中，其主要以基因簇、單拷貝或多拷貝等形式存在〔7〕。miRNA可直接參與調(diào)節(jié)血管生成，還可對(duì)促血管生成因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而起到調(diào)節(jié)血管生成的作用〔8，9〕。既往研究報(bào)道，有多種miRNA在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中起到關(guān)鍵作用〔10〕，其中miRNA-21、miRNA-16、miRNA-214等呈高表達(dá)〔11，12〕，miRNA-145、miRNA-222呈低表達(dá)〔13，14〕。miRNA-195是miRNA的一個(gè)重要類型，參與細(xì)胞缺氧的調(diào)控，也參與機(jī)體固有免疫的調(diào)節(jié)，以往的研究表明其與血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和分化具有相關(guān)性〔15〕。VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移中起到促進(jìn)作用，是一種重要的血管生成調(diào)節(jié)因子〔16〕。當(dāng)出現(xiàn)心肌缺血時(shí)，一方面可誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，大量炎性因子的釋放可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，進(jìn)而影響VEGF的分泌〔17〕；另一方面會(huì)出現(xiàn)心肌重塑而引起miRNA表達(dá)水平發(fā)生改變〔18〕。

本研究結(jié)果提示miRNA-195及VEGF可能與老年冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。王文峰等〔19〕研究報(bào)道顯示，miRNA-195與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性，可能為該類患者的臨床治療提供新思路。

本研究結(jié)果提示miRNA-195在冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄側(cè)支循環(huán)形成中發(fā)揮重要作用，可作為辨別側(cè)支循環(huán)形成的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。側(cè)支循環(huán)的建立利于緩解患者心肌缺血癥狀，可縮小心肌梗死范圍，減少心絞痛發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)，利于患者預(yù)后。張嫻等〔20〕研究報(bào)道，miRNA-195可通過(guò)促使VEGF的大量釋放，進(jìn)而促進(jìn)冠狀動(dòng)脈狹窄側(cè)支循環(huán)的建立，這與本研究結(jié)果一致。