腫瘤壞死因子α對(duì)小鼠心房細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的急性調(diào)節(jié)作用

左嵩 李林凌 蔣樂(lè) 劉念 董建增 馬長(zhǎng)生

炎癥與心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱(chēng)房顫)的發(fā)生密切相關(guān)。炎癥可導(dǎo)致房顫患者心房結(jié)構(gòu)重塑及纖維化，但心房結(jié)構(gòu)重塑或心房纖維化顯然不是急性炎癥相關(guān)房顫的潛在機(jī)制。既往研究顯示促炎性細(xì)胞因子能夠破壞心室肌細(xì)胞中的鈣調(diào)控穩(wěn)態(tài)[1-2]。Kao等[3]證明促炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的急性浸潤(rùn)可顯著增加心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的水平；Duncan等[4]的研究亦顯示，TNF-α對(duì)心室肌細(xì)胞的急性干預(yù)顯著提升了心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣漏的可能性，并促進(jìn)了致心律失常觸發(fā)活動(dòng)的增加。筆者探討急性TNF-α干預(yù)對(duì)心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)的影響及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞分離與實(shí)驗(yàn)試劑 成年雄性C57BL/6小鼠(20～25 g)購(gòu)自北京首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。所有的實(shí)驗(yàn)程序都經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且遵照動(dòng)物資源研究所編寫(xiě)并由國(guó)家衛(wèi)生研究院出版的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南”(出版物第23號(hào)，1996年修訂)。

心房肌細(xì)胞的分離采用雙酶促消化方案[5]。主要步驟如下：腹腔注射肝素0.5ml(100IU/ml)，15～20 min后脫頸處死，迅速取出心臟并經(jīng)主動(dòng)脈逆行插入套管并固定，用細(xì)胞灌流液沖灌心臟，清除冠狀動(dòng)脈內(nèi)血液后，改用心肌細(xì)胞雙酶促消化液循環(huán)沖灌約11 min，剪取心房組織后用鈍頭鑷子撕碎，加入少許酶解液，用滴管輕柔地吹打細(xì)胞，使細(xì)胞分散。加入終止酶解液1，離心(1 000轉(zhuǎn)/分)20 s，棄去上清，用終止酶解液2重懸細(xì)胞，并復(fù)鈣(鈣離子終濃度為1mmol/L)。至此心肌細(xì)胞準(zhǔn)備完畢，為了保證細(xì)胞的良好狀態(tài)，需在6 h之內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。

雙酶促消化液主要包括1.0 mg/mL的膠原酶(Ⅱ型；Worthington Biochemical公司，美國(guó))，0.05 mg/mL的蛋白酶(XIV型；Sigma公司，美國(guó))以及25 μmol/L CaCl2。細(xì)胞灌流液的主要成分如下(mmol/L)：NaCl 113、KCl 4.7、KH2PO40.6、Na2HPO40.6、MgSO41.2、NaHCO312、KHCO310、HEPES 10、葡萄糖5、?；撬?5、2,3-丁二酮單肟(BDM)10，溶液配置后在室溫下應(yīng)用NaOH溶液將pH調(diào)整為7.25。正常臺(tái)式液(NT)的主要成分如下(mmol/L)：NaCl 140、KCl 4.0、MgCl21.0、HEPES 10、CaCl22.0、葡萄糖5.0，pH 7.30。終止酶解液1：小牛血清1 ml+100 mmol/L CaCl24 ul+細(xì)胞灌流液9 ml；終止酶解液2：小牛血清0.5 ml+100 mmol/L CaCl24 μl+細(xì)胞灌流液9.5 ml；TNF-α(Sigma公司，美國(guó))應(yīng)用時(shí)在無(wú)菌PBS溶液中制備，將事先配好的濃度為200 μg/ ml的儲(chǔ)備溶液取出，并用無(wú)菌PBS溶液稀釋至0.05 ng/ml以備用。

1.2心房細(xì)胞內(nèi)鈣染色及鈣釋放活動(dòng)的測(cè)量 將新鮮分離的心房細(xì)胞溶液中加入5 μmol/L的fluo-4 AM溶液(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))，并置入28℃的暗室中染色20 min。加入細(xì)胞重懸液并離心，將染料洗去，并將細(xì)胞置于臺(tái)式液中保存。將完成鈣染色的心房細(xì)胞分為兩組，分別浸潤(rùn)在NT溶液(對(duì)照組)及0.05 ng/ml的TNF-α溶液(TNF-α組)中120 min以備用。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)量采用文獻(xiàn)發(fā)表的方案[6]。應(yīng)用IonOptix的系統(tǒng)(Milton公司，美國(guó))進(jìn)行單激發(fā)波長(zhǎng)微熒光測(cè)定，記錄靜息心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、自發(fā)性鈣波及肌漿網(wǎng)鈣容量。激光掃描共聚焦顯微鏡(型號(hào)SP5，Leica Microsystems公司，德國(guó))的線掃描模式(400 Hz)和Leica 60倍油鏡則用于記錄鈣火花的數(shù)量與特征等參數(shù)，包括鈣火花頻率(100 μm-1s-1)、幅值(F/F0)、時(shí)程(ms)，寬度(μm)和達(dá)峰時(shí)間(ms)。記錄時(shí)，首先對(duì)心肌細(xì)胞給予至少20 s、頻率1 Hz的場(chǎng)刺激(電脈沖寬度為4.0 ms，場(chǎng)強(qiáng)為40 V)使心肌細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定的肌漿網(wǎng)鈣容量；然后分別利用Ionoptix系統(tǒng)及激光掃描共聚焦顯微鏡記錄心肌細(xì)胞相關(guān)鈣參數(shù)。鈣釋放是心肌細(xì)胞在無(wú)咖啡因狀態(tài)下對(duì)1 Hz場(chǎng)刺激的反應(yīng)；而肌漿網(wǎng)鈣容量的測(cè)定則是利用咖啡因(10 mmol/L)能夠開(kāi)放肌漿網(wǎng)中所有RyR通道的特性而估測(cè)的。自發(fā)性鈣波為細(xì)胞內(nèi)鈣的非刺激性增加，通常在場(chǎng)刺激停止后的5 s內(nèi)自發(fā)性出現(xiàn)。熒光染料在波長(zhǎng)488 nm時(shí)激發(fā)，并在大于510 nm處收集。記錄鈣火花線掃描圖像后，使用Image J軟件中的spark master功能對(duì)鈣火花參數(shù)進(jìn)行分析。

1.3線粒體活性氧簇(ROS)生成測(cè)量 心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定采用MitoSOX Red(Molecular Probes公司，美國(guó))染色法[7]。首先，將1.1中制備完畢的心房肌細(xì)胞在室溫下用稀釋好的MitoSOX Red(5 μmol/ L)溶液浸潤(rùn)15 min。洗去染料后，將完成染色的細(xì)胞分為兩組，分別浸潤(rùn)在NT溶液(對(duì)照組)及0.05 ng/ml的TNF-α溶液(TNF-α組)中120 min以測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量及變化趨勢(shì)。共聚焦顯微鏡將通過(guò)488 nm激發(fā)及585 nm測(cè)量獲得共焦圖像。每30 min對(duì)心房細(xì)胞采集圖像并記錄MitoSOX紅色熒光強(qiáng)度。測(cè)量時(shí)取每個(gè)細(xì)胞的5個(gè)不同區(qū)域，測(cè)量并計(jì)算熒光強(qiáng)度，取均值作為該心房細(xì)胞的MitoSOX紅色熒光強(qiáng)度。并通過(guò)與基線處對(duì)照熒光強(qiáng)度的數(shù)值獲得MitoSOX紅色熒光強(qiáng)度(100%)的基線。

1.4數(shù)據(jù)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS(版本17)進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用Student′st檢驗(yàn)來(lái)確定兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。以P值<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1心房細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的比較 與對(duì)照組相比，TNF-α組的心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放幅值顯著下降，衰減時(shí)間則顯著增加，而兩組的達(dá)峰時(shí)間沒(méi)有差異(圖1，表1)。此外，TNF-α組的心房細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)容量顯著降低[( 8.05±0.59) F/F0 vs (9.45±0.67) F/F0;n=8，P<0.05]。

A為對(duì)照組；B為T(mén)NF-α組(0.05 ng/ml)

表1 TNF-α (0.05 ng/ml)急性干預(yù)2 h對(duì)心房肌細(xì)胞鈣釋放的影響

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2心房細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性鈣釋放活動(dòng)的比較 TNF-α組心房細(xì)胞內(nèi)鈣火花活動(dòng)顯著增強(qiáng)：鈣火花發(fā)生頻率大幅增加，鈣火花釋放幅值及時(shí)程也顯著改變，而鈣火花寬度和達(dá)峰時(shí)間雖略有改變，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2，表2)。

A為對(duì)照組，B為干預(yù)組

組別n頻率/s-1幅值/(F/F0)時(shí)程/ms寬度/μm達(dá)峰時(shí)間/ms對(duì)照組162.60±0.16(191)1.26±0.06(189)27.80±0.93(190)1.42±0.11(187)21.13±1.87(187)TNF-α組164.32±0.19?(301)1.07±0.26?(300)32.78±1.32?(303)1.45±0.10(298)19.18±1.30(300)

注：括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)代表鈣火花的數(shù)量；與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.3兩組ROS比較 與對(duì)照組相比，TNF-α組心房細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS的產(chǎn)生逐漸增加，在起始的60 min內(nèi)線粒體ROS產(chǎn)生緩慢，隨后迅速升高，120 min時(shí)ROS生成量增加至約2.26倍，而對(duì)照組在120 min內(nèi)沒(méi)有明顯增長(zhǎng)(圖3)。

3 討論

當(dāng)前，急性炎癥作為房顫發(fā)生的重要誘因這一觀點(diǎn)已被電生理主流學(xué)術(shù)界所逐漸接受[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，TNF-α能夠急性調(diào)節(jié)動(dòng)物心室肌細(xì)胞、乳鼠心肌細(xì)胞或HL-1細(xì)胞系中的離子通道功能與鈣循環(huán)調(diào)控; 但這些研究往往采用與臨床無(wú)關(guān)的超高濃度的TNF-α[1-3]，其與炎癥情況下機(jī)體TNF-α血清或組織濃度0.01～0.03 ng/ml水平相差甚遠(yuǎn)。為了有效地模擬臨床環(huán)境中的急性炎癥，筆者應(yīng)用0.05 ng/ml的TNF-α對(duì)小鼠心房細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行干預(yù)，并觀察其對(duì)鈣釋放的急性調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α的急性干預(yù)導(dǎo)致了心房細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變振幅降低、衰減時(shí)間延長(zhǎng)及肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)容量降低。心房細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變衰減時(shí)程的延長(zhǎng)意味著SERCA2a功能的受損，而后者的功能受損常常導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)容量的降低，從而造成鈣瞬變幅值的下降。既往研究顯示TNF-α能夠調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白的表達(dá)。Kao等[3]報(bào)道TNF-α可增強(qiáng)SERCA2a啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，并降低HL-1細(xì)胞系中SERCA2a的表達(dá)。Rao等[8]證實(shí)TNF-α能夠降低HL-1細(xì)胞系中T型鈣通道α1G亞單位的蛋白表達(dá)水平。然而，本研究中TNF-α僅僅急性干預(yù)2 h，顯然不能引起轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的改變，因此筆者推測(cè)轉(zhuǎn)錄后修飾很可能是TNF-α造成鈣調(diào)控紊亂的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

圖3 兩組線粒體ROS生成趨勢(shì)圖

觸發(fā)活動(dòng)被認(rèn)為是陣發(fā)性及慢性房顫發(fā)作的最重要機(jī)制之一。本研究清楚地表明在經(jīng)急性TNF-α處理的小鼠心房細(xì)胞中，自發(fā)性鈣釋放事件明顯增多，這與Duncan等[4]的研究成果相一致。其研究顯示TNF-α(0.05 ng/ml)急性干預(yù)3 h能夠顯著增加心室肌細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)自發(fā)性鈣漏，并增強(qiáng)其心律失常易感性。同時(shí)，心肌舒張期肌漿網(wǎng)自發(fā)性鈣釋放可導(dǎo)致鈉-鈣交換體的激活，產(chǎn)生瞬時(shí)凈向內(nèi)電流，進(jìn)而誘發(fā)舒張期后除極電位，誘發(fā)觸發(fā)性心律失常[9]。TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的線粒體ROS與多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)聯(lián)[10]。在心肌細(xì)胞中，線粒體體積占整個(gè)細(xì)胞體積的比例可高達(dá)30%～40%，同時(shí)線粒體還是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源[11]。在本研究中，MitoSOX Red被用來(lái)測(cè)量線粒體ROS的生成量，并且在心房肌細(xì)胞中TNF-α急性浸潤(rùn)2 h使線粒體ROS產(chǎn)生增加2倍以上。而多項(xiàng)研究顯示線粒體ROS可通過(guò)改變鈣調(diào)蛋白的表達(dá)而進(jìn)一步調(diào)節(jié)鈣調(diào)控，造成心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣紊亂[12]。因此，筆者推測(cè)TNF-α誘導(dǎo)的線粒體ROS增多是心房肌細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性鈣釋放事件的潛在分子生物學(xué)機(jī)制。

本研究的不足之處在于我們沒(méi)有全面評(píng)估心肌細(xì)胞內(nèi)各項(xiàng)鈣調(diào)控蛋白的表達(dá)。其次，我們應(yīng)用咖啡因誘發(fā)的鈣離子瞬時(shí)峰值來(lái)估測(cè)心房肌細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)容量。盡管該方法在本領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但與膜片鉗技術(shù)產(chǎn)生的瞬間內(nèi)向整合電流相比，其僅僅是一項(xiàng)替代性指標(biāo)而非肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)負(fù)載的最準(zhǔn)確指標(biāo)。