川南地區(qū)乳腺癌患者HER-2基因狀態(tài)及其蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系分析*

李 昕，阮思蓓，唐曉琴，羅斯譯，高子清，楊志惠，，肖秀麗，，劉 勇，，唐明?！?/p>

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000)

人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是定位于人染色體17q11.2～q12、編碼Her-2/neu蛋白的基因，正確評估HER-2狀態(tài)與判斷乳腺癌的分子分型、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及患者的治療預(yù)后密切相關(guān)[1-2]。目前，使用最普遍的方法是熒光原位雜交(fluorescence in situ hybrizization,FISH)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)法。本文根據(jù)《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》再次評價(jià)FISH和IHC檢測的一致性、相關(guān)性及與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，為臨床正確評估HER-2狀態(tài)提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年11月至2018年2月瀘州、內(nèi)江、宜賓、自貢等四川南部地區(qū)來西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行FISH和IHC檢測的898例浸潤性乳腺癌患者的石蠟標(biāo)本。所有病理均有完整的IHC[雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、Her-2/neu、Ki-67]及臨床病理特征(患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級)資料，通過復(fù)閱切片及FISH報(bào)告分別統(tǒng)計(jì)新舊標(biāo)準(zhǔn)下FISH結(jié)果及其差異。

1.2試劑與探針 IHC中ER、PR和Her-2/neu檢測使用羅氏公司抗體(ER克隆號：SP1；PR克隆號：1E2；Her-2/neu克隆號：4B5)；Ki-67使用北京中杉金橋公司生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(克隆號：MIB.I)。FISH檢測使用北京金普嘉公司HER-2基因擴(kuò)增試劑盒。

1.3方法

1.3.1FISH法 FISH法按北京金普嘉公司HER-2基因擴(kuò)增試劑盒說明書操作，參考文獻(xiàn)[3]。

1.3.2IHC法 IHC采用EnVision法，ER、PR及HER-2蛋白表達(dá)如PANIWANI等[4]所述。

1.4結(jié)果判定

1.4.1FISH結(jié)果判定 參考ASCO-CAP檢測指南[2]所建議的方法進(jìn)行再評價(jià)：(1)浸潤癌區(qū)域HER-2信號連接成簇狀，判讀為陽性；(2)隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)浸潤癌細(xì)胞的紅綠雙色信號數(shù)目。陽性：HER2/CEP17 Ratio≥2.0或者HER2/CEP17 Ratio<2.0，平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞大于或等于6.0；陰性：HER2/CEP17 Ratio<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞小于4.0；可疑：HER2/CEP17 Ratio<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥4.0～<6.0；可疑狀態(tài)的判定需要增加細(xì)胞計(jì)數(shù)或者另一位判讀者單獨(dú)計(jì)數(shù)細(xì)胞且結(jié)果一致。

1.4.2IHC結(jié)果判定 根據(jù)《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》[5]進(jìn)行評價(jià)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法檢測的一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，HER-2基因狀態(tài)及Her-2/neu蛋白表達(dá)與各臨床病理特征關(guān)系分析的組間比較用秩和檢驗(yàn)及Speaman等級相關(guān)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1IHC與FISH檢測HER-2的結(jié)果比較 在898例浸潤性乳腺癌病理標(biāo)本中，IHC染色結(jié)果為-，+，++，+++(圖1)。FISH新舊標(biāo)準(zhǔn)下與IHC檢測結(jié)果的一致性見表1。新標(biāo)準(zhǔn)下，F(xiàn)ISH檢測HER-2基因擴(kuò)增率為30.96%(278/898)，可疑率為5.57%(50/898)，陰性率為63.47%(570/898)，見圖2。FISH與IHC檢測符合率如下：IHC(-/+)為93.79%(151/161)，IHC(++)為7.17%(44/614)，IHC(+++)為60.98%(75/123)。一致性檢驗(yàn)顯示FISH與IHC一致率為46.77%，結(jié)果存在一致性(Kappa=0.132,P=0.000)且呈正相關(guān)(r=0.351,P=0.000)，見表1。

表1 FISH及IHC檢測HER-2基因狀態(tài)新舊標(biāo)準(zhǔn)比較

新：根據(jù)《乳腺癌HER2檢測指南(2014版)》；舊：根據(jù)《乳腺癌HER2檢測指南(2009版)》

A:IHC，-無染色(×200);B：IHC+，>10%的浸潤癌細(xì)胞呈不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色(×200)；C：IHC++，>10%的浸潤癌細(xì)胞呈不完整和中等強(qiáng)度的細(xì)胞膜染色(×200)；D:IHC+++，>10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色(×200)

圖1 IHC評分結(jié)果圖片

A:陰性；B:可疑；C、D:陽性

圖2 FISH結(jié)果判讀圖片(CEP17為綠色信號，HER-2為紅色信號)

表2 Her-2/neu蛋白表達(dá)、HER-2基因狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性

續(xù)表2 Her-2/neu蛋白表達(dá)、HER-2基因狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.2HER-2基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 ER、PR、ER/PR表達(dá)狀態(tài)、腫瘤大小及組織學(xué)分級與HER-2基因擴(kuò)增(χ2=164.939,P=0.000;χ2=127.342,P=0.000;χ2=65.146,P=0.000;χ2=30.711,P=0.001;χ2=17.786,P=0.001)及Her-2/neu蛋白表達(dá)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.578,P=0.000;χ2=19.706,P<0.01;χ2=19.624,P<0.05;χ2=67.255,P=0.000;χ2=12.047,P<0.05)，年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)與HER-2基因擴(kuò)增間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與Her-2/neu蛋白表達(dá)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ER表達(dá)與HER-2基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.322,P<0.01;r=-0.114,P<0.01)，PR表達(dá)及ER/PR狀態(tài)與HER-2基因擴(kuò)增呈負(fù)相關(guān)(r=-0.177,P<0.01;r=-0.234,P<0.01)，與HER-2蛋白表達(dá)無關(guān)(P>0.05)。另外，年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)與HER-2基因擴(kuò)增狀態(tài)相關(guān)，而腫瘤大小和組織學(xué)分級與HER-2蛋白表達(dá)有關(guān)(表2)。

3 討 論

乳腺癌患者的HER-2狀態(tài)是臨床篩選用藥的重要指標(biāo)。美國臨床腫瘤學(xué)會/美國病理學(xué)家學(xué)會(ASCO/CAP)于2013年頒布了最新的乳腺癌HER-2檢測指南，我國也同步采用新版《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》。本文運(yùn)用該指南再次評價(jià)IHC及FISH檢測結(jié)果的一致性、相關(guān)性及其與臨床病理特征的關(guān)系。

HER-2基因擴(kuò)增及其受體蛋白的過表達(dá)被認(rèn)為與預(yù)后不良相關(guān)，乳腺癌患者HER-2狀態(tài)的評價(jià)對其治療和預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)作用[6-7]。本研究再次表明，新標(biāo)準(zhǔn)下FISH和IHC(-/+)的一致性為93.79%，與本文舊標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果(88.20%)及本課題組之前報(bào)道的87.50%[3]和93.67%[8]基本一致，也與大多數(shù)報(bào)道相符[4,9-11]。新標(biāo)準(zhǔn)下的FISH和IHC(++)一致性為7.17%，低于本文舊標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果的8.79%、STOSS等[12]報(bào)道的8.20%及MURTHY等[13]報(bào)道的16%～29%，說明FISH與IHC(++)一致性有所降低，提示IHC(++)者應(yīng)常規(guī)行FISH檢測，才能更準(zhǔn)確地評估HER2擴(kuò)增狀態(tài)。新標(biāo)準(zhǔn)下，F(xiàn)ISH和IHC(+++)檢測一致性為60.98%，略高于之前報(bào)道的58.80%[3]，但仍然明顯低于其他研究者的報(bào)道100.00%[4,9]、84.80%[11]。這也是本文FISH與IHC總符合率(46.77%)較低的主要原因，可能與IHC(+++)樣本量較少，以及樣本固定、IHC抗原修復(fù)方法、17號染色體多體等因素有關(guān)。另外，新舊指南均將IHC(+++)作為HER-2擴(kuò)增可直接行曲妥珠單抗治療。但本研究結(jié)果表明，IHC(+++)仍有一定比例患者HER-2基因無擴(kuò)增，基于MASS等[14]報(bào)道IHC(++)和(+++)患者中，HER-2基因擴(kuò)增患者應(yīng)用靶向藥物治療的總有效率及長期生存率顯著高于無基因擴(kuò)增患者，同時(shí)，許多臨床及科研工作者也推薦FISH作為應(yīng)用曲妥珠單抗治療的金標(biāo)準(zhǔn)[2,5]。因此，筆者認(rèn)為IHC(++)及(+++)者都應(yīng)進(jìn)一步行FISH檢測，以此完善診斷，指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。最新指南首次考慮了平均HER-2基因拷貝數(shù)對結(jié)果評價(jià)的影響，提高了FISH與IHC檢測的一致性，但是，臨床上究竟以IHC檢測HER-2/neu蛋白表達(dá)，還是以FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增作為應(yīng)用靶向藥物的最終依據(jù)，以及17號染色體多體對乳腺癌患者治療預(yù)后的影響，還有待長期、大量、多中心的臨床治療效果的判讀、研究及分析來得以完善和解決。

本文結(jié)果顯示ER表達(dá)與HER-2基因擴(kuò)增及HER-2/neu蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，PR表達(dá)、ER/PR狀態(tài)與HER-2基因擴(kuò)增呈負(fù)相關(guān)，這與NING等[11]及劉琪等[15]的結(jié)論基本一致。提示ER、PR表達(dá)與HER-2基因擴(kuò)增間可能存在共同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使其相互影響。因此，ER、PR和ER/PR狀態(tài)可以間接推測HER-2基因擴(kuò)增情況，且有報(bào)道ER- PR-患者預(yù)后較差[16]，這可能與其HER-2基因擴(kuò)增率高相關(guān)。此外，年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)與HER-2基因擴(kuò)增呈正相關(guān)，腫瘤大小和組織學(xué)分級與HER-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，這可能與HER-2基因擴(kuò)增后調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖，使腫瘤體積增大、組織學(xué)分級增高、淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與汪波等[16]報(bào)道的年齡和淋巴轉(zhuǎn)移與HER-2基因擴(kuò)增和Her-2/neu蛋白表達(dá)無關(guān)不同，其原因可能與不同的統(tǒng)計(jì)病例數(shù)等有關(guān)，其相關(guān)性仍需多中心、長期、大樣本分析。

綜上所述，IHC是檢測乳腺癌患者HER-2/neu蛋白表達(dá)的首選方法。但是FISH仍然是評價(jià)HER-2/neu蛋白IHC(++)及IHC(+++)基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法。最新HER-2檢測指南提高了FISH和IHC檢測的一致性，避免了部分假陰性及假可疑的存在。