磁性納米Fe₃O₄對(duì)黃鯽蛋白抗菌肽的富集作用

冀雪莉 韋榮編 宋茹

摘要 [目的]以磁性Fe3O4粒子為基粒，采用溶膠-凝膠法在基粒表面鍵合二氧化硅，將基粒制成改性磁性納米Fe3O4用于吸附黃鯽蛋白抗菌肽中的活性肽，從而達(dá)到對(duì)黃鯽蛋白肽中有效抗菌組分的快速分離富集。[方法]黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性納米Fe3O4吸附后，測(cè)定抑菌率、肽含量、蛋白質(zhì)含量和氨基酸含量指標(biāo)，再結(jié)合透射電鏡分析和高效液相分析結(jié)果，比較黃鯽蛋白肽在吸附前后的變化。[結(jié)果]透射電鏡結(jié)果顯示，改性磁性納米Fe3O4吸附黃鯽蛋白抗菌肽，可在粒子表面形成“冕層”。經(jīng)改性磁性納米Fe3O4吸附后，黃鯽蛋白抗菌肽液對(duì)大腸桿菌的抑菌作用顯著降低，其中黃鯽蛋白肽中的肽含量、蛋白質(zhì)含量分別由吸附前的7.249 mg和416.221 μg降低至6.297 mg和346.183 μg，而吸附后肽液中氨基酸含量則略有提高。高效液相分析結(jié)果表明，黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性納米Fe3O4吸附后主要分離峰的保留時(shí)間和峰面積均發(fā)生改變。[結(jié)論]改性磁性納米Fe3O4能有效吸附黃鯽蛋白肽中的抗菌肽，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗菌組分的分離富集作用。

關(guān)鍵詞 黃鯽蛋白肽;抗菌;磁性Fe3O4粒子;表面修飾;富集

中圖分類號(hào) TS254.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）10-0141-03

Abstract [Objective]The magnetic Fe3O4 particles was modified by combining the silica layer using the solgel method，with the aim of enrichment of antibacterial peptide from halffin anchovy hydrolysates （HAHp）.[Method]Determine the inhibition rate，peptide content，protein content and amino acid content of absorbed HAHp，and combine the results of transmission electron microscopy and high performance liquid phase analysis to compare the changes of HAHp before and after adsorption.[Result]Transmission electron microscopy showed that a coronal layer was formed on the surface of modified magnetic Fe3O4 after treated with HAHp.The antibacterial activity of HAHp was significantly reduced after adsorption by modified magnetic particles.The amounts of peptide and protein in HAHp were decreased from 7.249 mg to 6.297 mg，and 416.221 μg to 346.183 μg，respectively.By comparison，the amino acid content of HAHp was slightly increased after modified magnetic particles adsorption.Furthermore，the result of highperformance liquid phase analysis showed the changes of retention time and peak area for major peaks in HAHp after adsorbed by modified magnetic particles.[Conclusion]Our results suggested that the modified magnetic Fe3O4 particles could effectively enrich the antibacterial peptide from HAHp.

Key words Halffin anchovy peptides;Antibacterial activity;Magnetic Fe3O4 particles;Surface modification;Enrichment

黃鯽（Setipinna taty）屬于輻鰭魚綱、鯡形目、鳀科、黃鯽屬，在我國東海、南海、渤海等海域可以常年捕獲，且捕獲量較大[1]。通過酶解法制備的黃鯽蛋白肽除了抗菌活性外，還具有抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等生物活性[2-5]。前期研究中發(fā)現(xiàn)黃鯽蛋白肽的抑菌活性與其所帶電荷性有關(guān)[2]。磁性納米材料通常是由超順納米磁性粒子與無機(jī)或有機(jī)分子通過包覆或交聯(lián)等方式形成，可均勻分散于溶液中保持較高穩(wěn)定性。將磁性納米材料作為吸附劑，不僅具有較高的比表面積、良好的生物相容性，而且基于磁性材料的分離富集操作簡(jiǎn)單，能夠快速達(dá)到吸附平衡，所以在生物工程中的應(yīng)用越來越廣泛[6-7]。該研究以磁性Fe3O4為基粒，經(jīng)表面修飾改性使基粒表面帶有更多的荷電基團(tuán)，如羥基、氨基[8]，將改性后的磁性Fe3O4用于吸附黃鯽蛋白肽中有效抗菌肽，以達(dá)到快速分離、富集抗菌肽的目的。

1 材料與方法

1.1 主要材料

黃鯽蛋白肽（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備）;Fe3O4購于上海阿拉丁集團(tuán);檸檬酸三鈉購于宜興市第二化學(xué)試劑廠;正硅酸乙酯、乙醇、氨水、氫氧化鈉、氯化鈉、濃鹽酸、鄰苯二甲醛（OPA）、甲醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四硼酸鈉、β-巰基乙醇、G-250考馬斯亮藍(lán)，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;營養(yǎng)瓊脂，購于青島海博生物技術(shù)有限公司;總氨基酸試劑盒和總巰基試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 磁性Fe3O4納米粒子修飾改性。

參照文獻(xiàn)[9]的方法并適當(dāng)修改，以Fe3O4為基粒，制備改性磁性Fe3O4粒子。

1.2.2 改性磁性Fe3O4納米粒子吸附黃鯽蛋白抗菌肽。

將磁性Fe3O4納米粒子與黃鯽蛋白肽按照1∶100比例（mg/mL）混合，微量振蕩器振蕩1 h，磁鐵分離磁性Fe3O4納米粒子，收集吸附后黃鯽蛋白肽，備用。

1.2.3 改性磁性Fe3O4納米粒子的微觀結(jié)構(gòu)表征。透射電鏡法觀察改性磁性Fe3O4納米粒子吸附黃鯽蛋白肽后的微觀結(jié)構(gòu)，未吸附黃鯽蛋白肽的改性磁性粒子為對(duì)照。

1.2.4 抑菌性測(cè)定。

參照96孔板法[4]測(cè)定，以大腸桿菌為指示菌，測(cè)定黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附前后抑菌率。

1.2.5 肽、蛋白質(zhì)和氨基酸含量測(cè)定。

測(cè)定黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附前后的肽含量、蛋白質(zhì)含量和氨基酸含量變化。肽含量的測(cè)定采用OPA方法[10]，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法[11]，氨基酸含量測(cè)定采用總氨基酸測(cè)定試劑盒法。

1.2.6 吸附前后黃鯽蛋白肽的色譜分離。

采用高效液相色譜法（HPLC）比較黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附前后主要分離峰變化，具體條件如下：樣品經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，進(jìn)樣量 10 μL，采用PL aquagel-OH柱（75 mm×300 mm，8 μm）分離，30%乙腈為洗脫劑，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長280 nm，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積判定吸附前后黃鯽蛋白肽中主要分離峰變化情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）形式表示，用SPSS 19.0 軟件對(duì)組間差異性進(jìn)行顯著分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性磁性Fe3O4納米粒子吸附黃鯽蛋白肽前后微觀結(jié)構(gòu)比較

從圖1可以看出，改性磁性Fe3O4納米粒子在吸附黃鯽蛋白肽之前具有較為規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，尺寸分布較窄，粒徑均勻，直徑在100～200 nm。吸附黃鯽蛋白肽后改性磁性Fe3O4納米粒子直徑在50～250 nm，表面被淺層膜包裹，形成了“核殼結(jié)構(gòu)”磁性粒子。磁性納米Fe3O4經(jīng)改性后可在粒子表面鍵合大量的-OH、-COOH等帶負(fù)電荷基團(tuán)[12]。推測(cè)改性磁性Fe3O4納米粒子表面形成類似“水膜”層與黃鯽蛋白肽中的正電荷肽吸附到粒子表面有關(guān)。

2.2 黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附后抑菌率變化

抑菌率和肽含量變化是評(píng)價(jià)改性磁性Fe3O4納米粒子對(duì)黃鯽蛋白肽中抗菌肽是否發(fā)生吸附的重要指標(biāo)，如果經(jīng)納米粒子吸附后黃鯽蛋白肽的抑菌率和肽含量降低，說明黃鯽蛋白肽的有效抗菌肽組分被改性磁性Fe3O4納米粒子吸附。

從表1可看出，黃鯽蛋白肽對(duì)大腸桿菌的抑菌率由吸附前的42.52%降至吸附后的28.22%（P<0.05），經(jīng)測(cè)定黃鯽蛋白肽的肽含量和蛋白質(zhì)含量分別由吸附前的7.249 mg和416.221 μg降低至6.297 mg和346.183 μg（P<0.05），而吸附后黃鯽蛋白肽溶液中氨基酸含量則由吸附前的14.656 mg提高至16.581 mg（P<0.05）。表明改性磁性Fe3O4納米粒子能有效吸附黃鯽蛋白肽中抗菌肽組分，綜合圖1微觀結(jié)構(gòu)分析，說明被改性磁性Fe3O4納米粒子吸附到粒子表面形成的“水膜”應(yīng)與抗菌作用有關(guān)的抗菌肽吸附有關(guān)。

2.3 黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附后色譜分離

圖2a分離結(jié)果顯示黃鯽蛋白肽主要有7個(gè)分離峰，經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附后，圖2b中對(duì)應(yīng)的峰2（P2）吸光強(qiáng)度降低明顯，說明峰2在吸附后的黃鯽蛋白肽中含量降低。另外，圖2a中峰5（P5）的保留時(shí)間在圖2b中延長。王嶺[12]報(bào)道磁性Fe3O4粒子經(jīng)表面改性后可以選擇性吸附疏水性多肽或荷電多肽。綜合以上結(jié)果，可以判定該研究所用的改性磁性Fe3O4納米粒子能有效吸附黃鯽蛋白肽中抗菌肽組分。

3 結(jié)論

該研究通過溶膠-凝膠法制備了改性磁性Fe3O4納米粒子，通過吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，被吸附后的黃鯽蛋白肽的抑菌率降低、肽含量和蛋白質(zhì)含量降低、總氨基酸含量增加，說明改性磁性Fe3O4納米粒子能有效吸附黃鯽蛋白肽中抗菌肽，并能在磁性粒子表面形成蛋白或肽層。HPLC分離試驗(yàn)表明，黃鯽蛋白肽中的一些分離峰經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附后，強(qiáng)度或保留時(shí)間變化明顯，原因可能是與吸附后的黃鯽蛋白肽的抗菌活性變化有關(guān)，后續(xù)還需進(jìn)一步探究被吸附的肽組分特征。

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