福建省福清地區(qū)馬鈴薯病毒病病原的分子檢測

楊小龍 陳細(xì)紅 蔡偉

摘要 2017年調(diào)查福建福清地區(qū)馬鈴薯病毒病的發(fā)生情況，以明確該地區(qū)馬鈴薯主要病毒病原。共采集了46份疑似感染病毒的馬鈴薯植株，提取總RNA，利用RTPCR技術(shù)進(jìn)行分子檢測，結(jié)果表明，福清地區(qū)危害馬鈴薯的病毒有馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）、馬鈴薯卷葉病毒Potato leaf roll virus（PLRV）、馬鈴薯S病毒Potato virus S（PVS），檢出率分別為56.52%、17.39%和10.87%，以PVY檢出率最高，說明PVY是危害該地區(qū)馬鈴薯樣品的主要病毒病原。通過病毒復(fù)合侵染進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在病毒復(fù)合侵染馬鈴薯現(xiàn)象。研究結(jié)果可為福清地區(qū)馬鈴薯種薯的引進(jìn)和病毒病害防治提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 福清地區(qū); 馬鈴薯病毒; RTPCR; 檢測與鑒定

中圖分類號： S 435.32

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018095

Abstract The aim of this study is to investigate the occurrence of potato viruses in Fuqing area， Fujian province， and to diagnose the main viruses causing major diseases. In 2017， 46 infected potato plant samples were collected from Fuqing area， and the total RNA was extracted from the infected potato leaves. From these samples， PVY， PLRV and PVS were detected via the conventional RTPCR techniques， and the detection rates were 56.52%， 17.39% and 10.87%， respectively， while other viruses were not detected. The analysis of complex infection showed that complex infection existed in potato plants in this area. This study can provide reference for the introduction of seed potato and the management strategy of virus diseases control in Fuqing area.

Key words Fuqing area; potato virus; RTPCR; detection and identification

馬鈴薯Solanum tuberosum L.是茄科茄屬一年生草本植物，起源于南美洲安第斯山地區(qū)，是一種兼具營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的食用塊莖作物[1]。馬鈴薯用途廣泛，既可以食用，也可以作為工業(yè)原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是世界四大糧食作物之一，與小麥、水稻、玉米、高粱并稱為世界五大作物。馬鈴薯在我國種植范圍廣，2007年我國馬鈴薯種植面積和總產(chǎn)量均排世界第一[2]。隨著馬鈴薯種植面積不斷擴(kuò)大，馬鈴薯受病毒病危害也愈發(fā)嚴(yán)重。馬鈴薯病毒病是引起馬鈴薯品種退化的主要原因，已經(jīng)成為馬鈴薯上重要的病害之一，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量，一般使馬鈴薯減產(chǎn)20%～50%，危害嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%以上，嚴(yán)重制約了馬鈴薯的生產(chǎn)[3]，給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失。目前，國內(nèi)外已報(bào)道的可侵染馬鈴薯的病毒有近40種，類病毒1種[4]。我國常見的、并且危害比較嚴(yán)重的有馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）、馬鈴薯X病毒Potato virus X（PVX）、馬鈴薯卷葉病毒Potato leaf roll virus（PLRV）、馬鈴薯S病毒Potato virus S（PVS）以及馬鈴薯M病毒Potato virus M（PVM）[57]。PVY是感染馬鈴薯的重要病毒之一，也是分布最為廣泛的病毒，幾乎所有馬鈴薯種植區(qū)都有該病毒。通常馬鈴薯感染PVY后會(huì)減產(chǎn)20%～40%，若同時(shí)還感染PLRV，PVX，馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒Potato spindle tuber viroid （PSTVd）等病毒及類病毒，其減產(chǎn)可達(dá)60%～80%[89]。目前，PVY全基因組結(jié)構(gòu)分析與分子變異的情況是其主要的研究方向。高芳鑾等[10]對中國14個(gè)省采集的馬鈴薯Y病毒CP基因分子變異進(jìn)行了研究。PLRV廣泛分布于馬鈴薯種植區(qū)，可通過種薯、蚜蟲等方式進(jìn)行傳播，其單獨(dú)侵染可導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)30%～90%，與其他病毒復(fù)合侵染可致絕收[11]。PSTVd是危害馬鈴薯的重要類病毒，也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的類病毒。PSTVd 導(dǎo)致馬鈴薯品質(zhì)急劇退化，馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)[12]。此外，世界已報(bào)道的感染馬鈴薯的病毒還有安第斯馬鈴薯潛隱病毒 Andean potato latent virus（APLV）、馬鈴薯黃矮病毒Potato yellow dwarf virus（PYDV）、馬鈴薯帚頂病毒Potato mop top virus （PMTV）、馬鈴薯V病毒potato virus V（PVV）、苜?；ㄈ~病毒Alfalfa mosaic virus（AMV）和煙草脆裂病毒Tobacco rattle virus（TRV）等。

對病毒病的防治目前尚無有效藥劑，現(xiàn)階段主要以預(yù)防為主，高效可靠的病毒檢測是預(yù)防的重要前提[13]。目前廣泛應(yīng)用于馬鈴薯病毒檢測的方法主要有血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法[14]，其中以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionPCR， RTPCR）技術(shù)最為成熟，并越來越多地應(yīng)用于馬鈴薯病毒檢測上。聶峰杰等[15]應(yīng)用RTPCR技術(shù)對寧夏馬鈴薯脫毒種薯進(jìn)行了病毒檢測。Kumar等[16]應(yīng)用多重RTPCR同時(shí)檢測侵染馬鈴薯的5種病毒。沈林林等[17]采用多基因聯(lián)合方法對福清產(chǎn)區(qū)馬鈴薯Y病毒株系組成進(jìn)行鑒定。福建省馬鈴薯的種植面積和產(chǎn)量占全國比例較少，福清地區(qū)作為福建省馬鈴薯重要的種植生產(chǎn)區(qū)，屬于中國馬鈴薯南方冬作區(qū)，近年來，福清地區(qū)馬鈴薯受病毒病的危害日益加劇，給馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量帶來了嚴(yán)重的影響，因此，明確福清地區(qū)馬鈴薯病毒病發(fā)生情況和病毒種類，對福清地區(qū)馬鈴薯病毒病的防控具有重要意義。目前還沒有該地區(qū)侵染馬鈴薯的主要病毒種類的相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用常規(guī)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）對福清地區(qū)馬鈴薯進(jìn)行病毒的檢測，明確了該地區(qū)馬鈴薯病毒病發(fā)生情況和病毒種類，為福清地區(qū)馬鈴薯種薯的引進(jìn)和病毒病害防治提供參考依據(jù)，為促進(jìn)該地區(qū)馬鈴薯種薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年，在福建省福清地區(qū)采集花葉、斑點(diǎn)、褪綠、卷葉皺縮、黃化、小葉黑點(diǎn)等疑似感病的馬鈴薯樣品46份，對其編號后立即儲(chǔ)存于-80℃的冰箱里備用。

TransZol Up Plus RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、抑制酶和2×Green Master Mix購自Promega公司，其他生化試劑均為分析純;所有特異性引物由上海生物工程有限公司合成（表1）。

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

采用TransZol Up Plus RNA 提取試劑盒提取RNA。提取前，預(yù)先配制好需要加入無水乙醇的試劑，稱取鮮重為0.1 g的馬鈴薯葉片，加液氮研磨呈粉狀，再根據(jù)試劑盒說明書操作，最后將得到的總RNA立即保存于-80℃冰箱。

將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。向PCR反應(yīng)管中分別加入樣品總RNA 3 μL，隨機(jī)引物1 μL，ddH2O 7 μL，72℃ 10 min，冰上5 min。繼續(xù)分別加入MMLV RT 5×buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，MMLV Reverse Transcriptase 1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，42℃ 1 h，72℃ 10 min，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及凝膠電泳

馬鈴薯樣品PCR擴(kuò)增體系：2×Green Master Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，cDNA 2 μL，補(bǔ)足ddH2O 到25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min;94℃ 30 s，退火 45 s（各引物的退火溫度見表1），72℃ 1 min，共35 個(gè)循環(huán);最后，72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。在120 V恒壓條件下電泳25 min后，在凝膠成像系統(tǒng)上查看結(jié)果并保存。

1.4 PCR產(chǎn)物克隆、測序及序列分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化、克隆后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，利用BLAST對克隆后測定的序列進(jìn)行相似序列的比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 福清地區(qū)侵染馬鈴薯的病毒種類

2.1.1 PVY的檢測結(jié)果

采用PVY特異性引物（表1）從46份樣品中，總共檢測出26份樣品感染了PVY病毒，其中部分樣品電泳結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，陽性樣品擴(kuò)增出長度為801 bp的目的條帶，陰性（健康馬鈴薯葉片）對照未擴(kuò)增到相應(yīng)的片段。

2.1.2 PLRV的檢測結(jié)果

該地區(qū)采集的46份馬鈴薯樣品中，共8份樣品出現(xiàn)了PLRV特異性擴(kuò)增條帶（圖2），長度為627 bp，且與預(yù)期片段大小一致，而陰性對照未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶。

2.1.3 PVS的檢測結(jié)果

利用PVS特異性引物對福建省福清地區(qū)的采集的46份馬鈴薯疑似帶毒樣品進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，共5份擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳呈陽性條帶（圖3），與預(yù)期片段885 bp相一致，而陰性對照未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶。

2.2 PCR產(chǎn)物的克隆和測序結(jié)果

將馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯S病毒（PVS）陽性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行克隆、測序和序列分析，結(jié)果表明，從PVY陽性樣品中獲得801 bp的目的片段，其核苷酸序列與已報(bào)道的PVY分離物（GU07400）CP核苷酸序列同源性為99.5%;從PLRV陽性樣品上獲得627 bp的目的片段，其核苷酸序列與已報(bào)道的PLRV分離物（FJ859023）CP基因序列同源性為99.8%;從PVS陽性樣品上獲得885 bp的目的片段，其核苷酸序列與已報(bào)道的PVS分離物（Y15625）CP基因序列同源性為95.3%。序列分析結(jié)果證實(shí)，PVY、PLRV和PVS陽性樣品中擴(kuò)增到的目的片段與已報(bào)道的各病毒CP核苷酸序列高度同源，進(jìn)一步驗(yàn)證了3種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

2.3 病毒檢出率

對福建省福清地區(qū)采集的46個(gè)馬鈴薯樣品檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（表2）表明，PVY、PLRV、PVS檢出率分別為56.52%、17.39%和10.87%，以PVY檢出率最高，說明PVY是危害該地區(qū)馬鈴薯的主要病毒病原。此外，檢測結(jié)果表明，福清地區(qū)馬鈴薯病毒存在復(fù)合侵染，主要為PVY和PLRV復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為4.35%。

3 結(jié)論與討論

福清市位于福建省東南沿海一帶，是福建省馬鈴薯主要種植生產(chǎn)區(qū)之一。近年來，福清地區(qū)馬鈴薯受病毒病的危害日益嚴(yán)重，給該地區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，關(guān)于福清地區(qū)馬鈴薯主要病毒種類尚未見調(diào)查研究報(bào)道。近年來國內(nèi)外已報(bào)道的侵染馬鈴薯的病毒及類病毒超過40種，其中在我國危害比較嚴(yán)重的有PVY、PVX、PVS、PVM、PLRV和PVA。PVA、PYDV、PMTV、PVV、PSTVd 5種病毒被列入我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄。PMTV在國外研究報(bào)道較多，國內(nèi)較少。該病毒隨土壤中的馬鈴薯粉痂菌Spongospora subterranea進(jìn)行傳播，病毒在粉痂菌休眠孢子內(nèi)部至少可存活2年，在生產(chǎn)實(shí)踐中難以發(fā)現(xiàn)該病毒。PSTVd是唯一被發(fā)現(xiàn)侵染馬鈴薯的類病毒，其寄主范圍廣。PSTVd引起的病害發(fā)現(xiàn)于1922年，但直到1967年及以后的研究中才逐漸認(rèn)識引起該病害的病原[25]。本研究利用常規(guī)RTPCR技術(shù)對福清地區(qū)疑似感病的馬鈴薯樣品進(jìn)行主要病毒種類的檢測鑒定。結(jié)果在該地區(qū)檢出PVY、PLRV和PVS，其檢出率分別為56.52%、17.39%和10.87%。其中，PVY檢出率最高，說明PVY是危害該地區(qū)馬鈴薯的主要病毒。通過對該地區(qū)馬鈴薯病毒復(fù)合侵染情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，以PVY和PLRV復(fù)合侵染為主。此外，本研究利用PVA、PYDV、PMTV、PVV和PSTVd 5種病毒特異性引物對福清本地馬鈴薯樣品進(jìn)行檢疫性病毒檢測，均未檢出這5種檢疫性病毒。目前，還沒有任何藥劑能對馬鈴薯病毒進(jìn)行有效防治，現(xiàn)階段的防治方法主要是脫毒種薯的生產(chǎn)和抗病毒病品種的選育。采用脫毒種薯是預(yù)防病毒病最有效的一項(xiàng)措施，現(xiàn)已在馬鈴薯生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛。本研究采用13對特異性引物對福清地區(qū)46份馬鈴薯樣品進(jìn)行病毒病原檢測，明確了該地區(qū)馬鈴薯病毒病發(fā)生情況和病毒種類，其結(jié)果可為福清地區(qū)馬鈴薯脫毒種薯的生產(chǎn)和抗病毒病品種的選育提供保障，同時(shí)還可為該地區(qū)馬鈴薯種薯的引進(jìn)和病毒病害防治提供參考。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）