貯藏期蒜薹表面真菌群落組成分析

付麗 范昆 金巖

摘要 蒜薹作為一種傳統(tǒng)常年供應(yīng)的蔬菜深受喜愛，由于貯存時(shí)間長(zhǎng)，貯存過程中會(huì)有多種真菌產(chǎn)生，導(dǎo)致蒜薹失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文通過提取貯藏期蒜薹表面真菌的基因組DNA，經(jīng)Illumina平臺(tái)對(duì)7個(gè)樣本的ITS擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，共獲得2 418 016條raw reads，51個(gè)OTUs。通過OTU物種注釋和物種豐度聚類，優(yōu)勢(shì)真菌屬組成為：青霉菌屬Penicillium 81.08 %，未知子囊菌15.13%，耐冷酵母Mrakia 1.74%，小球殼屬M(fèi)ycosphaerella 1.02 %。青霉菌是貯藏蒜薹后期表面的主要真菌。

關(guān)鍵詞 貯藏蒜薹; 真菌; 擴(kuò)增子測(cè)序; ITS; 多樣性分析

中圖分類號(hào)： S 436.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018216

Abstract Garlic bolt is a kind of traditional vegetable in China. Due to long storage， the rot associated with fungi makes garlic bolts lose their economic value. In this study， the genomic DNA of seven samples of garlic bolts from cold storage was extracted， and the ITS region was amplified and sequenced on Illumina Miseq platform. A total of 2 418 016 raw reads and 51 OTUs were obtained. Through the OTU species annotation and species abundance clustering， the dominant fungal groups were Penicillium （81.08%）， unassigned ascomycete fungi （15.13%）， Mrakia （1.74%） and Mycosphaerella （1.02%）. It indicated that Penicillium was the major fungal group on the garlic bolts during the later stage of garlic bolt storage.

Key words garlic bolt; fungus; amplicon sequencing; ITS; diversity analysis

蒜薹是中國(guó)獨(dú)有的蔬菜品種，是大蒜Allium sativum L.抽出的幼嫩花莖，由薹梗和薹苞組成。由于其鮮嫩可口，深受廣大消費(fèi)者青睞。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年中國(guó)蒜薹年貯量約94.255萬(wàn)t，是國(guó)內(nèi)外貯藏量最大的單一蔬菜品種[1]。受蒜薹低溫休眠與春化栽培生理的局限，蒜薹生產(chǎn)通常只能秋播春收每年一季，采收后通過低溫氣調(diào)保鮮供應(yīng)全年。但貯藏期蒜薹腐爛常導(dǎo)致許多貯藏庫(kù)蒜薹損失高達(dá)30%～40%。明確貯存期間導(dǎo)致蒜薹腐爛的病原真菌種類迫在眉睫[2]。

擴(kuò)增子測(cè)序就是通過PCR擴(kuò)增，將目標(biāo)區(qū)域DNA富集后進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)Internal transcribed spacer （ITS）區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，可以實(shí)現(xiàn)環(huán)境微生物中真菌多樣性分析[3]。MiSeq測(cè)序系統(tǒng)采用邊合成邊測(cè)序的技術(shù)，每次運(yùn)行最多能產(chǎn)生超過7 Gb的數(shù)據(jù)。目前采用MiSeq平臺(tái)對(duì)ITS的測(cè)序，具有測(cè)序深度高、利于鑒定群落中低豐度物種以及費(fèi)用低的特點(diǎn)，已成為研究真菌群落多樣性的首選之策[4]。本文通過提取貯藏后期蒜薹表面真菌的基因組DNA，采用高通量測(cè)序的方法對(duì)ITS的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，對(duì)貯藏后期蒜薹中真菌的群落組成及多樣性進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

貯藏蒜薹樣品的采集地點(diǎn)為山東省濟(jì)寧市金鄉(xiāng)縣魚山鎮(zhèn)億客隆冷庫(kù)，冷庫(kù)容積為3 800 m3，貯藏溫度控制在-0.4～-0.8℃，平均濕度控制在70%～80%，蒜薹貯藏方式為貨架式，共19層，層間距為38 cm，蒜薹總儲(chǔ)藏量為280 t。蒜薹來自濟(jì)寧市金鄉(xiāng)縣及周邊12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的蒜薹農(nóng)業(yè)種植戶，品種為‘金鄉(xiāng)紅薹，入庫(kù)時(shí)間為2017年5月3日～5月11日，每天蒜薹入庫(kù)量為30～40 t，蒜薹梢朝外放置，由上至下、由內(nèi)向外依次擺放于貯存架上，直至庫(kù)滿。蒜薹經(jīng)過預(yù)降溫后裝入65 cm×110 cm的蒜薹專用硅窗袋中，每個(gè)硅窗袋存放19～20 kg蒜薹。2017年12月在此冷庫(kù)東、西、南、北、中五點(diǎn)隨機(jī)采樣，鑒于冷庫(kù)存儲(chǔ)量巨大，又隨機(jī)選取2份樣品，共計(jì)7份，編號(hào)為A、B、C、D、E、F、G。每份樣品的采集量為1 kg，保留完整的蒜薹整體（薹體和薹梢），0℃條件下保存，送樣至上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行真菌群落組成分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 貯藏期蒜薹發(fā)病率調(diào)查

蒜薹在貯存過程中薹體霉?fàn)€就失去商品價(jià)值，所以對(duì)貯存蒜薹發(fā)病率的調(diào)查使用病梢率法。對(duì)A～G 7個(gè)采集樣品的貯藏蒜薹隨機(jī)抽取200根用于發(fā)病率的調(diào)查，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)被侵染的蒜薹數(shù)量，計(jì)算發(fā)病率。

發(fā)病率=發(fā)病數(shù)量調(diào)查數(shù)量×100%。

調(diào)查數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行處理，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.2 基因組DNA提取

蒜薹樣品使用無菌水振蕩洗脫表面微生物，洗脫液經(jīng)離心，取沉淀進(jìn)行DNA抽提，采用CTAB法提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至20 ng/μL[5]。

1.2.3 7個(gè)樣本的ITS1區(qū)域擴(kuò)增

對(duì)7個(gè)樣本ITS1區(qū)域[3]進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增（MiSeq Reagent Kit v3，Illumina， USA），使用特異引物Primer F（Illumina adapter sequence 1+CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和Primer R（Illumina adapter sequence 2+GCTGCGTTCTTCATCGATGC），擴(kuò)增體系以及擴(kuò)增程序參照Mukherjee等[6]的方法。擴(kuò)增體系為：樣本DNA（20 ng/μL）2.5 μL，Primer F（1 μmol/L）5 μL， Primer R（1 μmol/L） 5 μL，2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL，共25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性 3 min;95℃ 變性 30 s，55℃ 復(fù)性 30 s，72℃ 延伸 30 s，25個(gè)循環(huán);72℃ 延伸 5 min。

每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL 與帶有Index 序列的引物（Nextera XT Index Kit， Illumina），通過高保真PCR 向文庫(kù)末端引入特異性標(biāo)簽序列。擴(kuò)增體系以及擴(kuò)增程序參照Mukherjee等[6]的方法。體系為：Index Primer 15 μL，Index Primer 25 μL，PCR mix 25 μL，無菌水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性 3 min;95℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，8個(gè)循環(huán);72℃ 延伸 5 min。PCR產(chǎn)物為樣本的原始文庫(kù)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物混樣與純化

PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用試劑盒 （MiSeq Reagent Kit v3， Illumina， USA）回收目的條帶。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的初步定量結(jié)果，對(duì)已經(jīng)帶有各自Index標(biāo)簽的樣本文庫(kù)進(jìn)行3～5倍稀釋，然后利用Qubit3.0對(duì)文庫(kù)進(jìn)行精確定量，根據(jù)不同樣本的測(cè)序通量要求，按相應(yīng)摩爾比例混合樣本。

1.2.5 文庫(kù)制備、庫(kù)檢與上機(jī)測(cè)序

混樣后的文庫(kù)通過生物分析儀（Agilent 2100 Bioanalyzer，USA）檢測(cè)測(cè)序文庫(kù)插入片段的大小，確認(rèn)在120～200 bp 之間無非特異性擴(kuò)增，并準(zhǔn)確定量測(cè)序文庫(kù)濃度。采用Miseq平臺(tái)（上海昊天生物技術(shù)有限公司）2×250 bp的雙端測(cè)序策略對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

1.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控與統(tǒng)計(jì)

對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾：使用TrimGalore軟件去除序列末端質(zhì)量低于20的堿基并去除可能包含的adapter序列，之后去除長(zhǎng)度小于100 bp的短序列;使用Flash軟件（V1.2.7，http：∥ccb.jhu.edu/software/FLASH/）將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)序列進(jìn)行拼接，得到merge序列，進(jìn)一步去除merge后低質(zhì)量序列（超過90%的堿基質(zhì)量低于20）;使用Mothur軟件（https：∥www.mothur.org/）查找并去除序列中的引物，刪除包含N堿基/homopolymer超過6 bp的序列;使用usearch去除總堿基錯(cuò)誤率大于2的序列以及長(zhǎng)度小于100 bp的序列，得到質(zhì)量和可信度較高的優(yōu)化序列（clean reads），該數(shù)據(jù)將用于后續(xù)生物信息分析。

1.3.2 OTU聚類和物種注釋

使用UPARSE軟件（http：∥www.drive5.com/usearch/）去除singleton序列，以97%的相似性對(duì)序列進(jìn)行聚類，相似度大于97%的序列將聚為同一個(gè)OTU（operational taxonomic units），同時(shí)使用denovo模式去除嵌合體序列，最終產(chǎn)生的OTU代表序列將用于后續(xù)物種注釋。使用Mothur軟件將每條OTU代表序列與Unit數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)完成OTU分類學(xué)注釋，并分析各樣本在分類水平統(tǒng)計(jì)中的群落組成。

1.3.3 真菌物種α多樣性分析

采用Chao l、Shannon、Simpson、覆蓋度等對(duì)蒜薹表面真菌OTU進(jìn)行α多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷庫(kù)貯藏蒜薹發(fā)病率

對(duì)采集的樣品進(jìn)行發(fā)病率統(tǒng)計(jì)（表1），結(jié)果表明7個(gè)樣本的發(fā)病率均在7%以上，E樣品的發(fā)病率最高，為11.17%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明7個(gè)樣本之間的差異不顯著（P>0.05）。

2.2 真菌ITS序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

A～G 7個(gè)樣本經(jīng)Illuminate Miseq平臺(tái)高通量測(cè)序共得到2 418 016條clean reads，總堿基數(shù)585 923 487 bp，得到51個(gè)OTUs，拼接后的序列平均長(zhǎng)度在249.80 bp。各樣本的Raw reads、Merge、Primer 和Clean reads 統(tǒng)計(jì)如表2所示。

2.3 蒜薹樣本真菌群落組成分析

使用R軟件（MathSoft，USA）以UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)為參比，對(duì)Clean reads進(jìn)行分類，樣品中鑒定到的真菌分為2門8綱15目21科27屬。子囊菌門真菌占比達(dá)到97.54%，而擔(dān)子菌門真菌只占2.46%。對(duì)A～G 7個(gè)樣本中平均占有率>1%的優(yōu)勢(shì)菌綱進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表3），從大到小為散囊菌綱Eurotiomycetes（81.08%）、錘舌菌綱Leotiomycetes（15.21%），銀耳綱Tremellomycetes（2.46%）和座囊菌綱Dothideomycetes（1.07%）。除Tremellomycetes綱，其他三個(gè)綱均為子囊菌門真菌Ascomycota。A～G 7個(gè)樣品中，優(yōu)勢(shì)菌綱占有率稍有差異，但最優(yōu)勢(shì)菌綱均為Eurotiomycetes。

對(duì)A～G 7個(gè)樣本中平均占有率>1%的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表4），優(yōu)勢(shì)菌屬有青霉屬Penicillium、未知子囊菌、耐冷海洋嗜殺酵母Mrakia、小球殼屬M(fèi)ycosphaerella、低溫酵母屬Cystofilobasidium、假裸囊菌屬Pseudogymnoascus和耐冷酵母屬Guehomyces。A～G 7個(gè)樣品中，Penicillium平均占比81.08%，E樣本中占比最大，為94.48%，占比最少為C樣本（61.60%）。酵母屬真菌雖整體平均占比>1%，但不是所有樣品中都有檢出，Mrakia在樣本A、C、E中未檢出;Cystofilobasidium在樣本G中未檢出;Guehomyces在樣本A、C、E中未檢出。表明子囊菌門真菌為貯藏蒜薹上普遍存在的真菌種類，而青霉屬是最優(yōu)勢(shì)菌種。

對(duì)蒜薹表面真菌的OTU在屬水平上進(jìn)行了Heatmap展示（圖1），各屬在7個(gè)樣品中分布存在差異。樣品A和B、D和E的真菌群落組成相似度更高，被分別聚類到一個(gè)分支，而其他樣品則單獨(dú)聚為一支。7個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)真菌均為青霉屬真菌。

2.4 7個(gè)樣品真菌物種α多樣性分析

真菌的稀釋曲線（圖2）、香農(nóng)指數(shù)曲線（圖3）表明，隨著序列條數(shù)的增加，曲線趨于平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，基本覆蓋樣品中的類群。

3 討論

蒜薹貯藏病害的已有研究主要涉及蒜薹表面致病菌的分離鑒定和生物學(xué)特征[78]，關(guān)于蒜薹表面真菌群落結(jié)構(gòu)組成尚未見報(bào)道。本研究利用高通量DNA測(cè)序技術(shù)分析了山東濟(jì)寧金鄉(xiāng)冷庫(kù)貯藏蒜薹樣品的真菌多樣性，結(jié)果共得到2 418 016條raw reads，51個(gè)OTUs。通過OTU物種注釋和物種豐度聚類，最終得到主要的真菌組成為：子囊菌門和擔(dān)子菌門;優(yōu)勢(shì)真菌屬組成為： Penicillium、Mrakia、Mycosphaerella、Cystofilobasidium、Pseudogymnoascus、Guehomyces。不同樣品蒜薹表面真菌組成相似，其中，以青霉屬真菌占有率最高，酵母也有一定的占有率。

與以往報(bào)道相比，本研究中灰霉Botrytis cinerea和匍柄霉Stemphylium solani等主要致病菌并未大量檢出。究其原因可能為：① 青霉屬真菌的生物學(xué)特性適應(yīng)貯存條件。青霉菌可以在0～50℃的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，并保持致病能力。趙淑艷等[7]的研究表明青霉菌對(duì)蒜薹有致病性，致病性略低于灰霉菌和匍柄霉菌。蘇建紅等[9]的研究表明在低溫條件下青霉菌可侵染貯藏期洋蔥，而且無傷也可侵染，可見低溫條件下青霉依然保有侵染能力。7個(gè)樣品的發(fā)病率無顯著差異的結(jié)果也表明，占有率最高的青霉屬是此次調(diào)查的貯藏蒜薹上的主要真菌類群。②青霉菌對(duì)防治藥劑產(chǎn)生抗性。王金龍[10]對(duì)湖北省柑橘致病青霉進(jìn)行咪鮮胺抗藥性分析，發(fā)現(xiàn)78株指狀青霉中有25株為抗性菌株，占比32%。而咪鮮胺是蒜薹冷庫(kù)貯存的首選藥劑。本試驗(yàn)中所采樣本為生產(chǎn)中正常處理的樣本，藥劑熏蒸或藥劑蘸梢等防治方式有效抑制了其他致病菌的發(fā)展，但對(duì)青霉菌的抑制效果不佳，也直接導(dǎo)致了貯藏蒜薹的發(fā)病率升高。

青霉屬真菌是低溫貯藏類果蔬的主要致病真菌，冬棗、柑橘、枸杞等水果的低溫貯藏中均有發(fā)現(xiàn)青霉屬真菌[1113]。青霉菌侵入果肉組織后，首先破壞了果實(shí)細(xì)胞壁的纖維素，進(jìn)而將果實(shí)細(xì)胞的果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)、淀粉、有機(jī)酸、糖類等分解為簡(jiǎn)單的物質(zhì)，給酵母和細(xì)菌創(chuàng)造了生長(zhǎng)的條件，使之得以大量繁殖。本研究中大量檢出了耐冷酵母，與趙瑩等[12]對(duì)貯藏后期的柑橘果實(shí)中分離到多種酵母的報(bào)道相一致。蒜薹經(jīng)過微生物的侵染繁殖后，表面長(zhǎng)出青灰色霉層，表皮組織變軟、凹陷，并產(chǎn)生各種酸味、臭味，從而失去商品價(jià)值。

高通量測(cè)序方法可檢測(cè)出培養(yǎng)法無法檢出的難培養(yǎng)真菌，還確定了樣品中大多數(shù)真菌的相對(duì)豐度，更直觀地揭示了貯藏后期蒜薹表面真菌的群落組成，為下一步真菌的分離、鑒定及致病性測(cè)定提供了方向，也為防治藥劑的篩選提供了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）