藍布正提取物對老年癡呆模型小鼠學習記憶能力及海馬區(qū)ＴＮＦ－α、ＡＫＴ表達的影響

胡祖林 張源文 劉楊

【摘要】目的：觀察藍布正提取物對阿爾茨海默癥（AD）模型小鼠學習記憶能力及相關蛋白表達的影響。方法：將54只KM小鼠隨機分為6組：正常對照組、模型對照組、陽性對照組、藍布正高、中、低劑量組。除正常對照組注射等體積生理鹽水外，其余各組小鼠每天皮下注射D-半乳糖聯(lián)合腹腔注射亞硝酸鈉復制AD模型小鼠。造模的同時灌胃相應溶媒，除正常對照組和模型對照組灌胃等體積蒸餾水外，其余各組灌胃相應藥物，連續(xù)60d。后行水迷宮檢測小鼠的逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)。水迷宮結束后，麻醉小鼠取腦組織，免疫組織化學法檢測腦組織TNF-α、AKT的表達。結果：與正常對照組比較，模型對照組逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺的次數(shù)顯著減少，TNF-α、AKT的表達顯著增高;藍布正各劑量組較模型組上述指標明顯改善。結論：藍布正對D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉復制的AD小鼠有改善作用，能下調炎癥因子的表達，增強老年癡呆小鼠的學習記憶能力。

【關鍵詞】藍布正;老年癡呆;學習記憶能力;TNF-α;AKT

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）1-0020-05

Abstract：ObjectiveToobservetheeffectofGeiHerbaextractonlearningandmemoryabilityandrelatedproteinexpressioninalzheimersdisease（AD）modelmice.Methods54KMmicewererandomlydividedinto6groups：Normalcontrolgroup，modelcontrolgroup，positivecontrolgroup，blueclothhigh，mediumandlowdosegroup.Inadditiontonormalcontrolgroup，othermiceineachgroupweresubcutaneouslyinjectedwithd-galactoseandintraperitoneallyinjectedwithsodiumnitritetoreplicateADmodelmice.Atthesametime，thecorrespondingsolventwaspouredintothestomach，exceptfordistilledwaterinthenormalcontrolgroupandthemodelcontrolgroup，thecorrespondingdrugwaspouredintothestomachinothergroupsfor60days.Thesubsequentwatermazewasusedtodetectthemicesescapelatencyandthenumberofcrossingplatforms.Afterthecompletionofwatermaze，braintissuewastakenfromanesthetizedmice，andtheexpressionofTNF-α，AKTwasdetectedbyimmunohistochemistry.ResultsComparedwiththenormalcontrolgroup，theescapelatencyperiodofthemodelcontrolgroupwassignificantlyprolonged，thenumberofcrossingtheplatformwassignificantlyreduced，andtheexpressionsofTNF-α，AKTweresignificantlyincreased.Comparedwiththemodelgroup，theaboveindexesweresignificantlyimprovedineachdosegroup.ConclusionGeiHerbahasanimprovedeffectond-galactosecombinedwithsodiumnitritereplicationinADmice，whichcandown-regulatetheexpressionofinflammatoryfactorsandenhancethelearningandmemoryabilityofseniledementiamice.

Keywords：GeiHerba;AlzheimersDisease;LearningandMemoryAbility;TNF-α;AKT

藍布正為薔薇科水楊梅屬植物柔毛路邊青GeumjaponicumThunb.var.chinenseBolle的干燥全草，在我國苗族地區(qū)民間常用來治療頭痛頭暈。2015年版《中國藥典》[1]記載，具有益氣養(yǎng)血的作用，臨床上常用于氣血虧虛。藍布正對大腦缺血缺氧具有改善作用，能有效緩解血虛導致的眩暈癥狀，有改善對大腦供血供氧及耐眩暈的作用[2]。研究表明藍布正對血管性癡呆大鼠的神經細胞具有明顯的保護作用[3-4]，能改善血管性癡呆大鼠的學習記憶能力[5]。

阿爾茨海默癥，是以無意識的記憶力緩慢下降為主要臨床表現(xiàn)的一種進行性中樞神經系統(tǒng)退行性疾病[6]。隨著我國老齡化人口的增長，阿爾茨海默癥的患病率逐年上升，據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2010年中國的阿爾茨海默病患者數(shù)量已如中國的人口數(shù)躍居世界第一位，2015年世界阿爾茨海默癥報告顯示，到2050年全球老年癡呆患者從目前的4600萬人增長至1.315億人口[7]，并以低收入和中等收入國家發(fā)病率最為明顯[8]，而以拉丁美洲、中國、印度等國家的增長幅度最高，將超過300%[8]。阿爾茨海默癥已成為患者和家庭的沉重負擔，給家庭和國家?guī)沓林氐慕洕鷫毫Α７乐嗡幬飮乐厝狈σ约八幬锔狈磻殉蔀楦鲊抑委熢摬〉奶魬?zhàn)，以此為目標的新藥研究旨在減輕家庭及社會的經濟壓力。筆者前期的動物實驗研究結果觀察，藍布正在對血管癡呆的防治有一定的效果，以此來觀察是否對老年癡呆也有很好的治療作用。

1材料與方法

1.1動物SPF級KM雄性小鼠54只，體重約18～22g，購置重慶解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（軍）2012-0011。

1.2藥品與試劑藍布正（采集貴州產藍布正，經貴陽中醫(yī)學院藥學院鑒定實驗室劉剛副教授鑒定為薔薇科水楊梅屬植物柔毛路邊青GeumjaponicumThunb.var.chinenseBolle），吡拉西坦片（批號：717H016，杭州民生藥業(yè)有限公司），D-半乳糖（批號：0902c052，BeiJingsolarbio），亞硝酸鈉（批號：170801，四川金山制藥有限公司），TNF-α（批號：ab34674，abcam公司），AKT抗體（批號：ab38449，abcam公司）。

1.3儀器Morris水迷宮（深圳瑞沃德生命科技有限公司），KD-BM型包埋機（浙江金華科迪有限公司），R-1010型旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿有限公司），SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司），RM2245型石蠟切片機（德國Leica公司），XSZ-HS3型顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

1.4方法

1.4.1老年癡呆小鼠模型的制備適應性喂養(yǎng)2天，將54只小鼠進行Morris水迷宮篩選，去除先天愚笨，游泳耐力很差的小鼠。經水迷宮篩選后所有小鼠合格，未見先天愚笨及耐力差的小鼠。將合格小鼠隨機分為6組，正常對照組（I組）、模型對照組（II）、陽性對照組（III）、藍布正高（IV）、中（V）、低（VI）劑量組。根據(jù)文獻[9-10]制備AD模型小鼠。除正常對照組注射等體積生理鹽水，其余各組皮下注射D-半乳糖聯(lián)合腹腔注射亞硝酸鈉，造模的同時給予灌胃相應藥物，除正常和模型對照組灌胃等體積生理鹽水，其余各組灌胃相應藥物，共60d。

1.4.2morris水迷宮檢測第61天進行Morris水迷宮檢測，向Morris水迷宮內灌水，水深剛好淹沒安全平臺1cm，水溫保持在（24±1）℃。整個水迷宮分為4個象限，每個象限設有一個不同的標志物供學習記憶。每次訓練時，從平臺所在象限的正對象限內的任意地點將小鼠放進池中，投放小鼠時，使小鼠面向池壁。小鼠從下水到找到安全平臺的時間為逃避潛伏期，設為90s，超過潛伏期未找到安全平臺者，則記為90s。下水前3天進行適應性訓練，每天2次，第4天正式測試其逃避潛伏期，第5天撤出安全平臺，觀察其穿越安全平臺的次數(shù)。

1.4.3免疫組化檢測Morris水迷宮完成的第2天，使用4%的水合氯醛0.1mL/10g麻醉小鼠后，摘取大腦，用4%的多聚甲醛固定后，經脫水、透明、石蠟包埋、切片后進行免疫組化檢測。通過4個視野的積分吸光度IA平均值來反映炎癥因子TNF-α、AKT的表達量。

1.5統(tǒng)計學方法全部數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Morris水迷宮結果與正常對照組比較，模型對照組逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)減少（P<0.05）;與模型對照組比較，陽性對照組和用藥高、中劑量組逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數(shù)顯著增加（P<0.05）。各組小鼠游泳軌跡，與空白組相比，模型組小鼠游泳軌跡雜亂沒有秩序。見表1，如圖1所示。

2.2對腦組織海馬區(qū)TNF-α表達的影響TNF-α陽性顆粒呈棕黃色，主要在細胞質中表達。造模60天后，與正常對照組比較，模型對照組小鼠TNF-α表達顯著增高（P<0.01），神經細胞排列紊亂，結構欠清晰，表明D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘發(fā)小鼠腦組織炎癥損傷，成功建立了老年癡呆模型;與模型對照組比較，藍布正高劑量組TNF-α的表達顯著降低（P<0.05），表明高劑量藍布正提取物可提高抗炎癥損傷能力，改善小鼠腦組織損害狀況。見表2，如圖2所示。

2.3對腦組織海馬區(qū)AKT表達的影響AKT陽性顆粒呈棕色或棕黃色，主要在細胞漿中表達，與正常對照組比較，模型對照組小鼠AKT表達顯著增高（P<0.01），神經細胞排列松散，表明D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉可造成腦組織缺血缺氧，誘發(fā)小鼠腦組織炎癥損傷，成功建立了老年癡呆模型;與模型對照組比較，陽性對照組、藍布正高、中、低劑量組AKT表達有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05），表明高、中、低劑量藍布正提取物可提高抗炎癥損傷能力，改善小鼠腦組織損害狀況。表2，如圖3所示。

3討論

腫瘤壞死因子（TNF）在消耗性疾病中起了重要作用，又稱惡液質素。TNF-α的生物學活性占TNF總活性的70%～95%，目前常說的TNF多指TNF-α。在缺血缺氧性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中炎癥細胞因子TNF-α起著重要作用[11]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，腦組織在缺血缺氧病理生理過程中，存在多種炎癥因子的參與反應，導致缺血缺氧時腦細胞的損傷和壞死，腦組織缺血缺氧同時又加快炎癥反應，從而形成一個循環(huán)過程[12]。研究證實TNF-α在腦損傷后高度表達，并與腦組織病變的嚴重程度密切相關[13]。TNF-α是炎癥反應的重要介質，在中樞神經系統(tǒng)中的分泌可引起其他炎癥因子如IL-6等的釋放，在機體炎癥啟動、維持和消退中起著重要作用[14]。該研究中觀察到，模型對照組小鼠腦組織中TNF-α明顯增加，出現(xiàn)學記憶能力下降。

AKT的產生與AD的發(fā)病有一定關系。AKT與腦缺血所產生的氧自由基、炎癥反應等因素有關，并參與腦缺血的病理過程。AKT不但參與炎癥損傷還參與細胞凋亡。Girifn等[15]發(fā)現(xiàn)在AD患者腦內AKT活性的升高及下游底物的磷酸化可能與AD疾病的發(fā)生有關。TNF-α通過PI3K/AKT信號傳導通路活化NF-κB，最終引發(fā)過度的組織炎癥反應和損傷[16]。D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉能使小鼠大腦缺氧而發(fā)生炎癥反應。實驗結果顯示，連續(xù)2個月的造模方法，成功建立了老年癡呆小鼠模型。從炎癥角度建立老年癡呆模型也在一定程度上順應了有關學者提出的老年癡呆患者大腦中炎癥致病因素。前期實驗觀察藍布正能夠改善大鼠因大腦缺血而造成的學習記憶力障礙。有研究報告觀察藍布正在抗炎方面也體現(xiàn)了其較好的抗炎效果[17]。從本實驗觀察藍布正提取物能夠改善小鼠大腦缺血缺氧，下調炎癥因子的表達，減輕炎癥反應。

綜上，藍布正提取物可用于改善大腦缺血缺氧狀況，減輕炎癥反應，但其具體的作用機制還需要進一步的研究探討。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：350-351.

[2]劉楊，鄧穎，劉明，等.藍布正對大腦供血供氧及止血耐眩暈作用的影響[J].中藥藥理與臨床，2015（6）：97-100.

[3]賴泳，李輝，方春生，等.藍布正對小鼠腦缺血的保護作用[J].大理大學學報，2005（5）：44-45.

[4]劉明，鄧穎，劉楊，等.藍布正對大鼠梗死灶周圍大腦皮質神經元凋亡和蛋白表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016（17）：117-121.

[5]劉明，劉楊，鄧穎，等.藍布正提取物對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及海馬NT-3，BDNF蛋白表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2017（17）：154-158.

[6]彭丹濤.阿爾茨海默病的精準診治趨勢及綜合強化治療策略探討[J].中華老年病研究電子雜志，2016，3（1）：15-17.

[7]AssociationA.2015Alzheimersdiseasefactsandfigures[J].Alzheimers&Dementia，2015，11（3）：332-384.

[8]HampelH，PrvulovicD，TeipelS，etal.ThefutureofAlzheimersdisease：Thenext10yeas[J].ProgNeurobiol，2011，95（4）：718-728.

[9]羅煥敏，陳子晟.一種新的老年癡呆動物模型[J].中國老年學雜志，2003，23（3）：179-182.

[10]文彪，葉冰，董青青，等.老年性癡呆動物模型的研究進展[J].實驗動物科學，2009，26（1）：45-48.

[11]BaroneFC，ArvinB，WhiteRF，etal.TumornecrosisfactorA：Amediatoroffocalischemicbraininjury[J].troke，1997，28（6）：1233-1273.

[12]GibsonCL，ConstantinD，PriorMJ，etal.Progesteronesuppressestheinflammatoryresponseandnitricoxidesynthase-2expressionfollowingcerebralischemia[J].ExpNeurol，2005，193（2）：522-530.

[13]CastilloJ，MoroMA，BlancoM，etal.Thereleaseoftumornecrosisfactor-alphaisassociatedwithischemictoleranceinhumanstroke[J].AnnNeurol，2003，54（6）：811819.

[14]CojocaruIM，MusuroiC，IacobS，etal.InvestigateonofTNF-alpha，IL-6，IL-8andofprocalcitonininpatientswithneurologiccomplicationsinsepsis[J].RomJInternMed，2003，41（1）：83-93.

[15]GriffinRJ，MoloneyA，KelliherM，etal.ActivationofAkt/PKB，increasedphosphorylationofAktsubstratesandlossandaltereddistributionofAktandPTENarefeaturesofAlzheimersdiseasepathology[J].JournalofNeurochemistry，2005，93（1）：105–117.

[16]StephensonD，YinT，SmalstigEB，etal.Transcriptionfactornuclearfactor-kappaBisactivatedinneuronsafterfocalcerebralischemia.[J].JournalofCerebralBloodFlow&MetabolismOfficialJournaloftheInternationalSocietyofCerebralBloodFlow&Metabolism，2000，20（3）：592.

[17]劉坦，王健芬，劉志強，等.藍布正對小鼠抗炎作用的實驗研究[J].大理大學學報，2006，5（12）：4-6.

（收稿日期：2018-11-13編輯：劉斌）