結核分枝桿菌相關檢測試劑盒對結核分枝桿菌感染的診斷價值研究

曾海清，熊君暉，溫順華，林海軍，孫旭東

(首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院檢驗科,北京 100038;2.廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司研發(fā)部，福建廈門 361022)

結核病是一種由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的嚴重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，是我國重點控制的重大疾病之一，也是全球關注的公共衛(wèi)生問題和社會問題[1-5]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，目前全球有近1/3的人感染了MTB，其中我國MTB感染率高達44.5%，遠遠高于世界平均感染水平[6]。人被MTB感染后，大部分會成為無癥狀的潛伏性結核感染(LTBI)者；然而當機體免疫力降低時，則會導致MTB大量增殖，引發(fā)臨床疾病。目前約有10%的潛伏性結核感染者會發(fā)展成活動性結核[7]。如何快速診斷和治療，對防止結核病的傳播意義重大。

結核菌素皮試(TST)是最早用于檢測MTB感染的方法，但由于易受卡介苗和環(huán)境分枝桿菌的干擾，且在結核流行區(qū)域的靈敏度和特異度均很低，TST的作用越來越受到限制。近年來，一種利用MTB特有抗原在體外刺激外周血細胞以檢測T細胞應答作為MTB感染的診斷方法得到了較快的發(fā)展，對檢測MTB具有很高的特異度和靈敏度，在歐美國家已經(jīng)成為結核臨床常規(guī)檢測方法之一[8]。目前該方法的實現(xiàn)方式有2種：一種為酶聯(lián)免疫斑點法(TB-Elispot)，另一種為體外IFN-γ釋放實驗(TB-IGRA)。TB-IGRA方法因相對較低的設施條件要求和較好的臨床符合率而被美國疾病控制與預防中心(CDC)推薦作為替代TST的更優(yōu)方法。本試驗采用3種國內(nèi)外主流的檢測試劑，對醫(yī)院確診的結核病和非結核病患者進行檢測，擬評價不同方法對結核病診斷的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1樣本來源 評價病例樣本來自昆明市第三人民醫(yī)院、北京市老年醫(yī)院和廈門市疾病預防控制中心3家臨床研究中心，研究獲得了各臨床研究單位倫理委員會的批準，研究中入組所有病例均與受試者簽訂了《受試者知情同意書》。三家機構相關數(shù)據(jù)由萬泰公司提供。

1.1.2納入標準 能夠明確的MTB感染情況的人群：包括肺結核臨床患者、肺外結核臨床患者、普通人群中的無癥狀潛伏感染者、非結核肺部疾病患者，非結核志愿者。

1.1.2.1肺結核臨床患者 診斷原則如下，具備1～6中3項或7～8條中任何1項確診為肺結核：(1)典型肺結核臨床癥狀和胸部X線表現(xiàn)；(2)抗結核治療有效；(3)臨床可排除其他非結核性肺部疾患；(4)結核菌素(PPD)試驗(5TD)強陽性，+++以上(含)；血清抗結核抗體陽性；(5)痰結核菌PCR+探針檢測呈陽性；(6)肺外組織病理證實結核病變；(7)BALF檢出抗酸分枝桿菌；(8)支氣管或肺部組織病理證實結核病變。

1.1.2.2肺外結核臨床患者 診斷原則如下，具備1～3中2項可確診：(1)PPD(5TD)強陽性，+++以上(含)；(2)肺外組織病理證實結核病變；(3)抗結核治療有效。

1.1.2.3MTB隱性感染者(普通人群中的無癥狀潛伏感染者) 診斷原則如下，具備1～3中1項可確診：(1)PPD(5TD)強陽性，+++以上(含)；(2)PPD(5TD)近期陽轉；(3)結核病確切接觸史，接觸時間不少于12個月。

1.1.2.4無結核指征的其他疾病患者 診斷原則如下，具備1～2中2項可確診：(1)PPD(5TD)一般陽性或陰性，++以下(含)，近期未出現(xiàn)陽轉；(2)明確的非結核臨床診斷結果。

1.1.2.5無結核指征的普通人 診斷原則如下，具備1～2中1項可確診：(1)PPD(5TD)一般陽性，++以下(含)，近期未出現(xiàn)陽轉；(2)PPD(5TD)陰性；(3)臨床診斷未發(fā)現(xiàn)結核和肺部疾病。

1.1.3排除標準 (1)年齡小于18歲或大于等于68歲；(2)由MTB以外的其他分枝桿菌致病的患者；(3)免疫損害者(原發(fā)性免疫缺陷性疾病、接收放化療、免疫抑制藥物治療患者)；(4)結核病合并糖尿病患者。

1.1.4樣本情況 在本研究中MTB感染者病例共875例，其中包含肺結核臨床患者721例，肺外結核臨床患者35例，結核合并其他疾病患者樣本30例，MTB隱性感染者91例；非MTB感染者共353例，其中包含無結核指征的其他疾病患者91例和無結核指征的普通人262例。本研究中入組樣本的數(shù)量和組成如表1所示。

表1 樣本基本信息表(n)

1.2儀器與試劑 MTB相關γ-干擾素檢測試劑盒(體外釋放酶聯(lián)免疫法)(TB-IGRA試劑)為北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；QuantiFERON?-TB(QFT-GIT試劑)為澳大利亞Cellestis Limited公司生產(chǎn)；T-SPOT.TB試劑由Oxford Immunotec公司生產(chǎn)；酶標儀由Bio-Rad公司生產(chǎn)；DEM-3型洗板機由廣州市達瑞生物技術股份有限公司生產(chǎn)；ZXDP-B2080型37 ℃恒溫箱由上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)。

1.3實驗方法 將來自同一受試者的新鮮全血樣本，分別用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的MTB相關γ-干擾素檢測試劑盒(體外釋放酶聯(lián)免疫法)和澳大利亞Cellestis Limited公司生產(chǎn)的QuantiFERON?-TB試劑盒進行處理和檢測，同時隨機選取其中部份病例采集新鮮血并采用T-SPOT.TB試劑進行檢測。實驗操作嚴格按各廠家試劑盒說明書進行。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。靈敏度=結核感染者中檢出陽性例數(shù)/結核感染者樣本總數(shù)×100%。特異度=(非結核感染者樣本總數(shù)-非結核感染者中檢出陽性例數(shù))/非結核感染者樣本總數(shù)×100%。

2 結 果

2.1TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑的比較分析 兩家試劑對875例MTB感染者樣本和353例非結合桿菌感染者樣本共計1 228例臨床樣本的檢測結果如表2所示，TB-IGRA試劑診斷MTB感染的靈敏度為78.29%(685/875)，特異度為77.05%(272/353)；QFT-GIT試劑診斷MTB感染的靈敏度為74.63%(653/875)，特異度為80.74%(285/353)。TB-IGRA和QFT-GIT試劑在檢測靈敏度和特異度方面，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

在上述分析的1 228例病例中，采用T-SPOT.TB試劑對其中隨機的132例病例進行了追蹤檢測，結果如表3所示，TB-IGRA試劑診斷MTB感染的靈敏度為72.60%(53/73)，特異度為45.76%(27/59)；QFT-GIT試劑診斷MTB感染的靈敏度為50.68%(37/73)，特異度為40.68%(24/59)；T-SPOT.TB試劑診斷MTB感染的靈敏度為58.90%(43/73)，特異度為61.02%(36/59)，TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑在檢測靈敏度和特異度方面，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 TB-IGRA與QFT-GIT試劑檢驗結果判斷MTB感染的準確性分析(n)

表3 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑檢驗結果判斷MTB感染的準確性分析(n)

表4 TB-IGRA、QFT-GIT試劑與PPD結果比較分析

續(xù)表4 TB-IGRA、QFT-GIT試劑與PPD結果比較分析

注：無結果為未進行PPD檢測

2.2TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑與PPD結果比較分析 1 228例臨床病例樣本中，TB-IGRA、QFT-GIT試劑與PPD結果比較分析匯總如表4所示，PPD不同強弱的對象中，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑的檢出率的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；TB-IGRA試劑、QFT-GIT試劑檢出率與PPD結果具有相關性，由弱到強，均呈明顯增強趨勢，TB-IGRA試劑和QFT-GIT試劑對PPD檢測呈陽性的743例病例的檢出率分別為65.95%(490/743)，60.83%(452/743)。分析132例T-SPOT.TB試劑檢測的隨機病例，PPD呈陽性病例中，TB-IGRA試劑檢出率為67.47%(56/83)，QFT-GIT試劑檢出率為48.19%(40/83)，T-SPOT.TB檢出率為54.22%(45/83)，TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑對PPD陽性樣本的檢出率方面，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TB-IGRA檢出率高于QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑。

2.3TB-IGRA、QFT-GIT試劑與細菌培養(yǎng)、涂片結果比較分析 1 228例病例中，合計832例病例有細菌培養(yǎng)和涂片結果，TB-IGRA、QFT-GIT試劑檢測結果與細菌培養(yǎng)，涂片結果比較如表6所示。細菌學檢測結果不同的對象中，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑的檢出率的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；細菌學檢測陽性的對象中，TB-IGRA試劑和QFT-GIT試劑的檢出率均高于細菌學陰性對象。分析132例T-SPOT.TB試劑隨機檢測的病例，具備細菌培養(yǎng)和涂片結果的樣本共計45例，3家試劑與細菌培養(yǎng)、涂片結果比較如表7所示，TB-IGRA試劑與T-SPOT.TB試劑之間的檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高于QFT-GIT試劑。

表5 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑

注：無結果為未進行PPD檢測

表6 TB-IGRA、QFT-GIT試劑與細菌培養(yǎng)和涂片結果比較分析

表7 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑與

3 討 論

目前臨床對于結核病的診斷主要依賴于臨床癥狀、影像學特征和病原學診斷?；颊吲R床癥狀和影像學特征有助于疑似患者的發(fā)現(xiàn)，但進一步診斷需要結合病原學檢測[9-10]。MTB檢查是確診結核病最特異的方法，其中培養(yǎng)法被認為是臨床診斷結核病最特異的“金標準”，但該方法一般需2～8周方能獲得結果，靈敏度低，且易出現(xiàn)漏檢，嚴重影響結核病的早期診療[11-13]。PPD試驗的結果是目前國內(nèi)診斷潛伏感染主要依據(jù)，一般將PPD強陽性或短期內(nèi)從陰性轉為陽性，而無臨床結核病證據(jù)者判斷為結核菌潛伏感染者。其最大的缺點在于PPD是從MTB中粗提的抗原混合物，其中包含很多非MTB及卡價菌(BCG)的共同抗原成分，卡介苗的接種會造成假陽性，而人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者等自身免疫性疾病以及免疫力低下的人群中容易出現(xiàn)假陰性[14-15]。因而尋找靈敏度高，檢測時間短，特異度好，方便操作的MTB感染檢測試劑成為各方研究的重點。細胞免疫介導的MTB γ干擾素釋放試驗是近年為采用酶聯(lián)免疫吸附測定或酶聯(lián)免疫斑點法定量檢出受檢者全血或外周血單個核細胞對MTB特異度抗原的IFN-γ檢測釋放反應，用于結核菌潛伏感染的診斷。

在本研究中，通過對多中心臨床樣本的檢測，評價了3種檢測特異度抗原介導的細胞免疫反應試劑盒，通過對臨床入組的1 228例病例進行檢測分析，北京萬泰的TB-IGRA試劑和澳大利亞的QFT-GIT試劑在檢測肺結核感染的靈敏度和特異度方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均顯示了較高的靈敏度，TB-IGRA試劑診斷MTB感染的靈敏度為78.29%(685/875)，特異度為77.05%(272/353)；QFT-GIT試劑診斷MTB感染的靈敏度為74.63%(653/875)，特異度為80.74%(285/353)。TB-IGRA試劑、QFT-GIT試劑陽性率與PPD結果有相關性，由弱到強，均呈明顯增強趨勢，與PPD結果比較，TB-IGRA試劑和QFT-GIT試劑對PPD檢測呈陽性的743例病例的陽性檢出率分別為65.95%(490/743)，60.83%(452/743)。細菌學檢測結果不同的對象中，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑的檢出率的差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；細菌學檢測陽性的對象中，TB-IGRA試劑和QFT-GIT試劑的檢出率均高于細菌學陰性對象。對1228例病例分析結果顯示，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑對結核感染的性能一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

同時，在研究的1 228例病例中，隨機挑選了132例病例采用T-SPOT.TB試劑進行追蹤檢測，分析此132例病例樣本檢測結果。TB-IGRA試劑、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑在診斷MTB感染的靈敏度和特異度方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。分析132例T-SPOT.TB檢測的PPD呈陽性的病例檢測結果，TB-IGRA、QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑對PPD陽性樣本的檢出率方面經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TB-IGRA檢出率高于QFT-GIT試劑和T-SPOT.TB試劑。132例病例中具備細菌培養(yǎng)和涂片結果的樣本共計45例，TB-IGRA試劑與T-SPOT.TB試劑檢測出陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但高于QFT-GIT試劑。

4 結 論

北京萬泰生產(chǎn)的TB-IGRA試劑與QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑相比較，在檢測MTB感染方面性能無明顯差異。但相較于T-SPOT.TB試劑，TB-IGRA試劑與QFT-GIT試劑具有操作相對簡單、檢測時長更短、結果判讀簡單等優(yōu)勢，利于醫(yī)院檢驗科室的臨床檢測使用。同時TB-IGRA試劑作為國產(chǎn)試劑，在成本方面比QFT-GIT和T-SPOT.TB試劑具備更明顯的優(yōu)勢，可為我國各級醫(yī)療衛(wèi)生單位特別是基層醫(yī)療單位的MTB感染診斷提供更大的助力。