Let-7家族啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與胃癌的關(guān)聯(lián)研究

張 麒，艾 良

(云南省腫瘤醫(yī)院腹部外科，云南昆明 650118)

微小RNA(miRNA)來源于基因組DNA，經(jīng)過多步加工，由初始體miRNA發(fā)展到前體miRNA，再發(fā)展到成熟體miRNA。雖然不編碼蛋白質(zhì)，但是可與靶基因3′-非翻譯區(qū)結(jié)合發(fā)揮重要的調(diào)控功能。Let-7，最早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，包括10個(gè)家族成員，多以簇的形式存在，參與腫瘤的演變[1-2]。胃癌組織中，let-7多個(gè)家族成員低表達(dá)，具有類似于抑癌基因的作用，例如let-7a、let-7f和let-7i等[1,3-4]。最近，有研究報(bào)道，位于let-7家族成員啟動(dòng)子區(qū)的2個(gè)多核苷酸多態(tài)性(SNP)rs10877887和rs13293512不同等位基因可能與轉(zhuǎn)錄因子的親和力不同，引起let-7的異常表達(dá)和個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性不同，包括肝癌[5-7]、甲狀腺乳頭狀癌[8]、肺癌[9]和宮頸癌[10]。本研究探討rs10877887和rs13293512與中國漢族人群胃癌的相關(guān)性，旨在篩選胃癌新的易感基因,為胃癌的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

(4)道德素質(zhì)。道德素質(zhì)既是客服人員服務(wù)客戶的底限，也是提升客服工作水平的必要要素，道德素質(zhì)主要包括個(gè)體道德、職業(yè)道德、社會(huì)公共道德。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院腹部外科住院的經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為胃癌的172例患者作為病例組，另選取同期到本院參加臨床試驗(yàn)的健康者224例作為對(duì)照組。胃癌診斷采用美國癌癥聯(lián)合研究會(huì)2010(第七版)分期標(biāo)準(zhǔn)。病例組和對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：同意參加本次研究并愿意提供血液樣本者。病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：有腫瘤家族史、胃癌復(fù)發(fā)或其他部位原發(fā)癌轉(zhuǎn)移至胃者。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：有腫瘤家族史和急慢性胃炎者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選對(duì)象均簽署知情同意書。所有病例和對(duì)照臨床資料通過查閱醫(yī)院病歷資料獲得，查閱資料包括：性別、年齡、民族、家族史、居住地、腫瘤臨床特征(分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài))。病例組中，男117例，女55例，平均(58.7±12.5)歲；臨床Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者分別為82例和90例；高中分化和低分化癌分別為124例和48例；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各67例和105例。所有患者均未經(jīng)放化療和抗癌藥物治療。對(duì)照組中，男157例，女67例，平均(57.7±9.9)歲。兩組受試者來源于云南漢族人群，在性別、年齡、種族和居住地等方面匹配，彼此之間無血緣關(guān)系。

1.2樣本采集和DNA提取 采集入選研究對(duì)象空腹外周靜脈血2～3 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照全血基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司，北京)操作說明提取基因組DNA，運(yùn)用NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度。DNA純度在1.7～1.9并且濃度大于20 ng/μL的樣本符合要求，不符合要求者，重新提取DNA。

1.3Let-7啟動(dòng)子區(qū)rs10877887和rs13293512多態(tài)性檢測(cè) 采用TaqMan對(duì)rs10877887和rs13293512進(jìn)行分型。根據(jù)文獻(xiàn)[6]合成引物和探針，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列為：rs10877887上游：5′-CCC ATT TCC TGC TTT CGA G-3′，下游：5′-GCG TTC TGT ACG TCA GCC AC-3′; rs13293512上游：5′-GCA GGG AAG ACA GTG AAT GTT AAA-3′，下游：5′-CCA AGA AAG CAG TAT TAT CAA TGA AGT T-3′。探針序列為： rs10877887探針：FAM-CGG CTC TCC CCG CAG GAC-TAMRA,HEX-AGC GGC TCT CTC CGC AGG AC-TAMRA。rs13293512探針：FAM-CTG GTT GAG TTT TGC T-MGB,HEX-CTG GTT GAG TTT CGC TT-MGB。反應(yīng)體系(10 μL)如下：基因組DNA 20 ng，2×反應(yīng)混合物5.0 μL，引物和探針各0.25 μL，無菌去離子水補(bǔ)足10 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上設(shè)定如下擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，分析記錄數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。雙盲法判讀結(jié)果如下：rs10877887CC和rs13293512TT為藍(lán)色熒光；rs10877887TT和rs13293512CC為綠色熒光；rs10877887CT和rs13293512CT均為青色熒光。SNP分型結(jié)果經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，2種方法結(jié)果完全一致。

MiRNA雖然不編碼蛋白，但是作為重要的調(diào)節(jié)因子調(diào)控靶基因表達(dá)參與多種疾病的病理生理學(xué)過程；不僅與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且有望作為腫瘤診斷、治療和預(yù)后判斷新的標(biāo)記物[11-13]。以往研究顯示，miRNA啟動(dòng)子區(qū)遺傳變異可影響其表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤的易感性[14-16]。Let-7作為最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)miRNA，在腫瘤中的抑癌作用已經(jīng)得到證實(shí)，然而，并非所有l(wèi)et-7低表達(dá)的個(gè)體腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)均較低，提示不同個(gè)體存在遺傳差異。2011年，黃芳等[6]報(bào)道了位于let-7啟動(dòng)子區(qū)的2個(gè)功能性多態(tài)位點(diǎn)rs10877887和rs13293512：前者位于let-7i上游-286 bp處，后者位于let-7a-1/let-7f-1/let-7d基因簇上游-8 496 bp處。2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)不同等位基因與轉(zhuǎn)錄因子骨髓鋅脂1和干擾素調(diào)節(jié)因子1的親和力不同，可能影響let-7的表達(dá)并影響個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性差異[5-6]。關(guān)于這2個(gè)功能性SNPs與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的研究鮮有報(bào)道。本研究調(diào)查了rs10877887和rs13293512與胃癌的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)rs10877887 CC基因型和C等位基因增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，調(diào)整OR值分別為1.98和1.46。

2.2rs10877887和rs13293512多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 rs10877887和rs13293512多態(tài)性測(cè)序圖見圖1、2。兩位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系見表2。rs10877887 CC基因型攜帶者胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較TT基因型攜帶者增加了1.98倍(95%CI：1.11～3.54，P=0.02)；在顯性遺傳模型中，CT/CC基因型攜帶者胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較TT基因型攜帶者增加了1.53倍(95%CI：1.02～2.29，P=0.04)。rs10877887 C等位基因攜帶者胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較T等位基因攜帶者增加了1.46倍(95%CI：1.09～1.95，P=0.01)。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn) Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)見表1。rs10877887位點(diǎn)：病例組和對(duì)照組觀察值和期望值吻合度較好，χ2值分別為2.47和2.89，P值分別為0.12和0.09；rs13293512位點(diǎn)：病例組和對(duì)照組觀察值和期望值吻合度良好，χ2值分別為0.80和0.08，P值分別為0.37和0.77，表明兩位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性。

表1 病例組和對(duì)照組rs10877887和rs13293512

近年來，對(duì)Weitzenb?ck,Finsler-Hadwiger不等式的研究精彩紛呈，文[4]也總結(jié)了一系列研究成果，其中有：

圖1 rs10877887多態(tài)性測(cè)序圖

圖2 rs13293512多態(tài)性測(cè)序圖

多態(tài)性對(duì)照組[n(%)]病例組[n(%)]調(diào)整OR(95%CI)調(diào)整P值rs10877887 TT105(46.9)63(36.6)Reference CT89(39.7)73(42.4)1.37(0.88～2.12)0.16 CC30(13.4)36(20.9)1.98(1.11～3.54)0.02顯性模型 TT105(46.9)63(36.6)Reference CT/CC119(53.1)109(63.4)1.53(1.02～2.29)0.04隱性模型 TT/CT194(86.6)136(79.1)Reference CC30(13.4)36(20.9)1.71(1.00～2.91)0.05等位基因 T 299(66.7)199(57.8)Reference C149(33.3)145(42.2)1.46(1.09～1.95)0.01rs13293512 TT80(35.7)59(34.3)Reference CT113(50.5)85(49.4)1.02(0.65～1.58)0.94 CC31(13.8)28(16.3)1.20(0.65～2.22)0.57顯性模型 TT80(35.7)59(34.3)Reference CT/CC144(64.3)113(65.7)1.06(0.70～1.61)0.78隱性模型 TT/CT193(86.2)144(83.7)Reference CC31(13.8)28(16.3)1.21(0.69～2.10)0.51等位基因 T273(60.9)203(59.0)Reference C 175(39.1)141(41.0)1.08(0.81～1.44)0.60

3 討 論

最后，在現(xiàn)行管理中，教學(xué)督導(dǎo)、教師教育教學(xué)的獎(jiǎng)勵(lì)和違規(guī)處理、學(xué)生評(píng)教等方式方法各自獨(dú)立行事，沒有一個(gè)有機(jī)的結(jié)合，而教師本身是獨(dú)立完整的，教師的教育教學(xué)工作也是一個(gè)綜合的情況，不能由某一個(gè)單一的方面來確定。

本研究結(jié)果與肝癌、肺癌和宮頸癌中觀察到的結(jié)果一致。攜帶rs10877887 C等位基因的肝癌患者較T等位基因攜帶者生存期明顯縮短，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)1.22[5-6]。rs10877887 CT/CC基因型攜帶者較TT基因型攜帶者肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了103.2%，尤其60歲以上的人群，風(fēng)險(xiǎn)增加了585.7%[9]。rs10877887 CC基因型攜帶者宮頸鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了111%，并且let-7i表達(dá)量明顯降低[10]。與本研究結(jié)果不同的是，rs10877887 CT基因型攜帶者在雜合子、顯性遺傳模型和超顯性遺傳模型對(duì)比中均降低了甲狀腺乳頭狀癌的風(fēng)險(xiǎn)，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度分別為0.73、0.79和0.73；亞組分析顯示rs10877887 CC基因型攜帶者更易出現(xiàn)多發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌；rs13293512 CT/CC或者CC基因型攜帶者更不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]。許桂平等[17]運(yùn)用meta分析評(píng)價(jià)了rs10877887與癌癥的相關(guān)性，納入肝癌、頭頸癌、口腔癌和甲狀腺癌，發(fā)現(xiàn)CT/CC基因型降低了癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。導(dǎo)致以上結(jié)果不一致的可能原因是：(1)腫瘤類型不同，易感基因不同；(2)基因-基因和基因-環(huán)境交互作用的影響。

研究證實(shí)，胃癌中l(wèi)et-7多個(gè)家族成員(包括let-7a、7f和7i等)呈低表達(dá)，靶向丙酮酸激酶M2型(PKM2)和肌球蛋白重鏈9(MYH9)抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[1,3-4]。PKM2的過表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良預(yù)后有關(guān)，通過介導(dǎo)PI3K/AKT活化促進(jìn)細(xì)胞遷移并抑制自噬，導(dǎo)致胃癌的惡性演變[18-19]。MYH9通過環(huán)狀RNA-miRNA-mRNA的相互作用參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，沉默MYH9的表達(dá)可使胃癌細(xì)胞早期凋亡增加，細(xì)胞周期受阻于G2/M期[20-21]。由于rs10877887和rs13293512不同等位基因與轉(zhuǎn)錄因子骨髓鋅脂1和干擾素調(diào)節(jié)因子1的結(jié)合力不同，引起let-7的異常表達(dá)和個(gè)體對(duì)多種腫瘤的易感性不同[5-6]，由此認(rèn)為let-7啟動(dòng)子SNP-let-7表達(dá)PKM2/MYH9軸可能是胃癌發(fā)病的一條重要途徑?；谝陨媳尘埃狙芯坑^察到的rs10877887增加胃癌風(fēng)險(xiǎn)的可能機(jī)制是：位于let-7i啟動(dòng)子區(qū)的rs10877887C等位基因降低了具有抑癌作用的let-7i的表達(dá)量，對(duì)PKM2和/或MYH9的抑制作用減弱，致使胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。準(zhǔn)確機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)let-7i啟動(dòng)子區(qū)的rs10877887CC基因型增加了中國漢族人群胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示其為胃癌的易感基因之一。深入開展分子機(jī)制研究有助于全面了解rs10877887在胃癌中的作用。