化學(xué)發(fā)光法定量檢測抗ENA抗體和抗dsDNA抗體臨床性能評價

柳曉琴，崔亞利，沈 川，甘春玉，段義飛，彭磊文，李文勝△

(1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院臨床檢驗科,四川成都 610041；2.出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室,四川成都 610041)

自身抗體是機體B淋巴細胞成熟分化為漿細胞后產(chǎn)生的針對自身成分的抗體總稱，高效價自身抗體的產(chǎn)生是絕大多數(shù)自身免疫性疾病(AID)的特征之一。自身抗體對于AID的診斷、病情判斷、療效觀察具有重要作用，多種自身抗體已被納入AID診斷指南中[1]，自身抗體的靶抗原眾多，其中抗可提取物核抗原抗體(抗ENA抗體，包括抗Scl-70抗體、抗Sm抗體、抗Jo-1抗體、抗RNP/Sm抗體、抗SSB抗體、抗SSA抗體)是最常見的檢測指標(biāo)[2-5]。已有研究表明，抗雙鏈DNA抗體(抗dsDNA抗體)對診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)具有較高的特異度，特別是與狼瘡性腎炎有關(guān)，且滴度與SLE病情的進展相關(guān)[6]。與定性檢測相比，抗ENA抗體和抗dsDNA抗體定量檢測不僅可以更好地輔助疾病診斷，而且可以有效地反映病情、判斷預(yù)后和監(jiān)測療效。因此，已有的專家共識明確表示自身抗體的檢測結(jié)果建議以定量或半定量方式表達[7]。

臨床實驗室在開展自身抗體定量檢測方法選擇前，應(yīng)嚴(yán)格按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)EP系列文件的要求，對方法學(xué)開展臨床性能評價。本研究利用臨床樣本對SMART-6500化學(xué)發(fā)光自身抗體定量檢測平臺(SMART-6500)開展抗ENA抗體和抗dsDNA抗體檢測性能的評價，為臨床實驗室在抗ENA抗體和抗dsDNA抗體檢測方法學(xué)的選擇提供相應(yīng)的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年四川大學(xué)華西第二醫(yī)院常規(guī)開展抗ENA抗體和抗dsDNA抗體項目檢測的血清樣本共329例。其中包含76例SLE樣本和88例健康體檢樣本，其余165例為實驗室常規(guī)檢測樣本?？筪sDNA抗體國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(NIBCS代碼：15/174)從世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)制定機構(gòu)獲得。

1.2儀器與試劑 化學(xué)發(fā)光(CLIA)自身抗體定量檢測平臺(SMART-6500)由重慶科斯邁生物科技有限公司生產(chǎn)并提供。CLIA檢測試劑盒由江蘇浩歐博生物醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)并提供。抗ENA抗體檢測項目包括：抗核糖核蛋白抗體(anti-RNP)、抗史密斯抗體(anti-Sm)、抗干燥綜合征抗原A抗體(anti-SSA)、抗干燥綜合征抗原B抗體(anti-SSB)、抗硬皮病70抗體(anti-Scl-70)、抗組胺酰tRNA合成酶抗原抗體(anti-Jo-1)等6個不同項目。以上試劑盒(含質(zhì)控品和校準(zhǔn)品)的批號分別為20180224、20180224、20180329、20180224、20180702和20180614；抗dsDNA抗體檢測試劑盒的批號為20180801。每個試劑開展檢測前首先使用校準(zhǔn)品對檢測主曲線進行兩點校準(zhǔn)，在開展樣本檢測前通過檢測高值和低值質(zhì)控品測值確認檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性，從而確保樣本的檢測結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒由德國歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司提供，抗ENA抗體檢測項目包括：anti-RNP、anti-Sm、anti-SSA、anti-SSB、anti-Scl-70、anti-Jo-1等6個不同項目。以上試劑盒的批號分別為E181112CI、E180625DE、E180914AZ、E180601BQ、E180619IG和E181115BL，抗dsDNA抗體檢測試劑盒的批號為E180905CG。ELISA測定儀器為瑞士TECAN 150/3全自動酶免儀。

1.3方法

1.3.1CLIA檢測 試劑均嚴(yán)格按照說明書流程開展檢測，所有檢測均在配套的全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(SMART-6500)上全自動開展。除抗dsDNA抗體的檢測臨界值為10 U/mL之外，其他抗體的檢測臨界值均為20 RU/mL。

1.3.2ELISA檢測 試劑盒均嚴(yán)格按照說明書操作流程開展檢測。血清樣本按1∶201稀釋，加入包被特定靶抗原的微孔板中，室溫反應(yīng)30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100 μL酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，室溫反應(yīng)30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100 μL底物液，室溫反應(yīng)15 min，最后加入100 μL終止液，在酶標(biāo)儀中按照450和620 nm的雙波長進行光密度測量。根據(jù)光密度值計算抗體濃度并判讀陰陽性結(jié)果。除抗dsDNA抗體的檢測臨界值為100 U/mL之外，其他抗體的檢測臨界值均為20 RU/mL。

1.3.4線性試驗 參考CLSI的EP6-A2文件[9]，分別收集略低于廠家提供的線性范圍最高值的高值血清(H)和接近線性范圍低值的低值血清(L)，將高、低濃度標(biāo)本原液及1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀釋液共6管進行線性范圍檢測，對結(jié)果進行線性回歸分析，以稀釋度理論值為X值、測試值為Y值分別計算直線回歸相關(guān)系數(shù)R2值、r值、b值，看是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求：r應(yīng)不小于0.990 0，b在0.97～1.03范圍內(nèi)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。不同方法檢測結(jié)果的比較，采用四格表的χ2檢驗，2種方法檢測結(jié)果一致性的分析采用Kappa檢驗，一致性強度的判斷：當(dāng)Kappa<0.4，一致性強度較差；0.4≤Kappa<0.75，一致性一般；Kappa≥0.75，一致性良好。同時以SLE臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，繪制CLIA和ELISA檢測抗dsDNA抗體的受試者工作特征曲線(ROC曲線)，并借助曲線下面積(AUC)比較2種方法學(xué)針對SLE疾病診斷的準(zhǔn)確性。采用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗比較CLIA和ELISA檢測抗dsDNA抗體的量值相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1精密度試驗 應(yīng)用SMART-6500對抗ENA抗體和抗dsDNA抗體開展精密度驗證，結(jié)果顯示批內(nèi)精密度均<7%，批間精密度檢測結(jié)果均<13%。精密度試驗的詳細數(shù)據(jù)見表1。

2.2線性范圍試驗 應(yīng)用SMART-6500對抗ENA抗體和抗dsDNA抗體開展線性范圍驗證試驗，結(jié)果顯示抗ENA抗體和抗dsDNA抗體在廠商推薦范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的檢測線性，具體線性驗證結(jié)果見表2。

2.3CLIA和ELISA方法學(xué)比對驗證 應(yīng)用SMART-6500和ELISA對329例入組樣本開展抗ENA抗體和抗dsDNA抗體的平行檢測，結(jié)果顯示2種方法在檢測抗ENA抗體和抗dsDNA抗體時均表現(xiàn)出良好的一致性(Kappa>0.75)。見表3。

2.4SMART-6500和ELISA檢測抗dsDNA抗體的量值相關(guān)性及對SLE診斷準(zhǔn)確性分析 由于抗dsDNA抗體量值水平與SLE疾病活動度密切相關(guān)，因此采用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗對2種方法檢測量值開展相關(guān)性分析，結(jié)果顯示2種方法檢測量值具有顯著相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，Rho值為0.708(95%CI為0.655～0.760)，結(jié)果如圖1所示。以SLE診斷作為標(biāo)準(zhǔn)，借助76例SLE樣本和88例健康體檢樣本的檢測結(jié)果繪制ROC曲線，比較2種方法檢測結(jié)果對SLE疾病診斷的準(zhǔn)確度，結(jié)果顯示CLIA檢測結(jié)果對于SLE的疾病診斷準(zhǔn)確度更優(yōu)于ELISA。其中，CLIA的AUC為0.986(95%CI：0.973～0.998)，而ELISA的AUC為0.907(95%CI：0.858～0.957)。結(jié)果如圖2所示。

表1 應(yīng)用SMART-6500檢測抗ENA抗體和抗dsDNA

表2 應(yīng)用CLIA檢測抗ENA抗體和抗dsDNA抗體的線性范圍檢測結(jié)果

續(xù)表2 應(yīng)用CLIA檢測抗ENA抗體和抗dsDNA抗體的線性范圍檢測結(jié)果

表3 SMART-6500與ELISA檢測抗ENA抗體和抗dsDNA抗體的符合率和一致性分析

注：-表示無數(shù)據(jù)

圖1 SMART-6500與ELISA檢測抗dsDNA抗體的

2.5抗dsDNA抗體項目WHO國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測結(jié)果 2017年WHO正式發(fā)布抗dsDNA抗體國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(NIBCS代碼：15/174)。該國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)濃度為200 U/mL。通過SMART-6500檢測平臺對該國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開展檢測，按照標(biāo)準(zhǔn)進行換算后的濃度為24.67 U/mL?；谝陨蠙z測結(jié)果，SMART-6500平臺檢測結(jié)果轉(zhuǎn)化為國際標(biāo)準(zhǔn)量值的轉(zhuǎn)換因子為8.1。

圖2 ROC曲線比較2種方法檢測抗dsDNA抗體結(jié)果

3 討 論

AID的發(fā)病機理復(fù)雜，導(dǎo)致其難以被診斷和防治，但大部分患者體內(nèi)可檢測到一種或多種高滴度的自身抗體，而且自身抗體的滴度水平對疾病進程、療效和預(yù)后的都具有十分重要的臨床意義，因此，目前自身抗體檢測項目已經(jīng)成為AID相關(guān)科室的常規(guī)檢測項目。但國內(nèi)對自身抗體的檢測仍然停留在定性和半定量免疫學(xué)方法，難以滿足目前臨床實際需求[10]。隨著臨床免疫檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，新方法和新技術(shù)開始被應(yīng)用于自身抗體檢測，如液相芯片技術(shù)(MFI)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(PA)和CLIA等[11-14]。CLIA由于具有全自動、全定量、隨機上樣、靈活組合和質(zhì)控更嚴(yán)等優(yōu)勢和特點，已經(jīng)逐漸成為臨床免疫檢測領(lǐng)域的主流檢測技術(shù)，并且在腫瘤標(biāo)記物、傳染病、性激素和甲狀腺功能等領(lǐng)域發(fā)揮了重要的臨床價值。近年來，CLIA方法學(xué)已逐步應(yīng)用于自身抗體檢測領(lǐng)域，極大地促進國內(nèi)自身抗體檢測領(lǐng)域向全自動、全定量、隨機上樣和靈活組合等方向發(fā)展，同時提升實驗室自身抗體檢測的質(zhì)量控制水平。

但實驗室在采用CLIA方法開展自身抗體定量檢測前，均應(yīng)嚴(yán)格遵循實驗室質(zhì)量管理控制相關(guān)要求，對定量檢測平臺開展相應(yīng)的驗證。本研究采用臨床樣本及WHO國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照CLSI EP系列文件的要求，對SMART-6500自身抗體定量檢測平臺開展抗ENA抗體和抗dsDNA抗體的定量檢測性能驗證。驗證結(jié)果顯示，SMART-6500具有良好的精密度和線性檢測范圍，完全符合臨床免疫實驗室針對定量檢測相關(guān)性能的要求。與此同時，方法學(xué)比對試驗結(jié)果也同樣表明，SMART-6500與ELISA在檢測抗ENA抗體和抗dsDNA抗體時均表現(xiàn)出良好的符合度和一致性。但由于anti-Scl-70和anti-Jo-1在臨床常規(guī)檢測中的陽性率偏低，因此未來仍需要進一步擴大陽性樣本例數(shù)開展對比，從而獲得更加科學(xué)的對比結(jié)果。

抗dsDNA抗體作為SLE疾病的標(biāo)志性抗體，已經(jīng)被納入SLE相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。該抗體的量值水平與疾病的活動度密切相關(guān)。在本研究中不僅針對抗dsDNA抗體開展了定量檢測性能的驗證，同時還重點比較了2種方法學(xué)檢測抗dsDNA抗體的符合率、量值關(guān)系以及針對SLE的臨床診斷符合率。從結(jié)果可見，2種方法學(xué)檢測抗dsDNA抗體的一致性表現(xiàn)良好(Kappa=0.794，P<0.01)，而且檢測量值也存在一定的相關(guān)性(Rho=0.708，P<0.01)。但當(dāng)以SLE臨床診斷結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)繪制ROC曲線，比較2種方法檢測結(jié)果與SLE臨床診斷準(zhǔn)確度時，結(jié)果顯示SMART-6500檢測結(jié)果對SLE臨床診斷的準(zhǔn)確度更高(AUC=0.986，P<0.01)。上述2種方法在檢測抗dsDNA抗體的差異主要是由2種方法在抗原抗體包被及反應(yīng)體系的不同所造成。在ELISA中，雙鏈DNA抗原直接包被在聚丙乙烯微孔板上，該包被形式存在部分雙鏈DNA結(jié)構(gòu)解鏈為單鏈DNA的可能，因此可導(dǎo)致部分抗單鏈DNA抗體所引起的陽性結(jié)果。而SMART-6500則在磁微粒與抗原包被的處理上，采用的是生物素-親和素為介導(dǎo)的間接包被方式。核酸類物質(zhì)經(jīng)過小分子生物素化后，與親和素修飾的納米磁微粒實現(xiàn)結(jié)合，實現(xiàn)抗原與磁珠的間接包被。雙鏈DNA抗原間接包被不僅提高了包被效率，且實現(xiàn)了核酸類抗原在三維結(jié)構(gòu)上的全面展現(xiàn)，因此檢測結(jié)果對SLE的臨床診斷準(zhǔn)確度更高。

4 結(jié) 論

SMART-6500符合CLSI EP系列文件的相關(guān)定量檢測性能要求，同時還具備了全自動、隨機上樣、檢測線性范圍更寬和質(zhì)量控制更嚴(yán)等優(yōu)勢，因此在未來的臨床實踐中可作為抗ENA抗體和抗dsDNA抗體定量檢測方法的選擇之一。