新疆維吾爾族、哈薩克族和漢族疼痛敏感性與SLC6A4基因多態(tài)性的相關(guān)性研究

雷 波，柯雪萍,李新平,柯雪茹,曹興華△

(1 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院手術(shù)麻醉科,新疆烏魯木齊 830001;2 新疆哈密市中心醫(yī)院內(nèi)鏡室,新疆哈密 839000;3 新疆兵團(tuán)第七師醫(yī)院麻醉科，新疆奎屯 833200)

術(shù)后疼痛會(huì)刺激機(jī)體各系統(tǒng)產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者手術(shù)后生理和心理的恢復(fù)，近年來，越來越多的研究表明，疼痛敏感性在種族間存在差異，并且這種差異顯著存在于試驗(yàn)性疼痛和術(shù)后疼痛兩方面[1-2]。新疆地區(qū)是多民族融合的聚居區(qū)，主要以維吾爾族、哈薩克族和漢族為主，既往的研究表明，維吾爾族患者疼痛敏感性較高，疼痛耐受較其他民族差[3]。另一方面，多項(xiàng)研究表明5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(SLC6A4)與疼痛的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]，而SLC6A4基因多態(tài)性在這3個(gè)民族疼痛敏感性差異中的作用鮮有報(bào)道，本研究旨在通過觀察新疆地區(qū)維吾爾族、哈薩克族及漢族患者疼痛敏感性與患者SLC6A4基因多態(tài)性之間的相關(guān)性，為預(yù)測(cè)多民族地區(qū)個(gè)體術(shù)后疼痛程度提供理論依據(jù)，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化鎮(zhèn)痛治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2017年6月至2018年2月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院擬行結(jié)直腸癌根治手術(shù)的維吾爾族、哈薩克族和漢族患者各50例，實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的不適均提前告知患者，所有患者均自愿參加本實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書。本研究由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)并監(jiān)督開展。所有患者的基本資料間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 研究對(duì)象基本資料

1.2納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國麻醉協(xié)會(huì)(ASA)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)[6]；患者年齡范圍在18～55歲之間；腫瘤TNM分期為Ⅰ～Ⅲa期；無既往慢性疼痛史，且無長期服用鎮(zhèn)痛藥或類皮質(zhì)醇類藥物史；無內(nèi)分泌、精神或神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其他免疫疾?。粺o溝通障礙，自愿接受術(shù)后靜脈自控鎮(zhèn)痛(PCA)。排除標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)過程出現(xiàn)異常反應(yīng)，中斷術(shù)后試驗(yàn)性疼痛檢測(cè)者；行腹部微創(chuàng)手術(shù)者；有長期吸煙、酗酒史者；明顯肝、腎功能不全或心血管循環(huán)系統(tǒng)疾病者；對(duì)本試驗(yàn)過程安全性存在疑慮，無法配合試驗(yàn)者。

1.3手術(shù)方法 全部受治患者手術(shù)在標(biāo)準(zhǔn)氣管內(nèi)插管全身麻醉下進(jìn)行，麻醉劑量：咪達(dá)唑侖0.05 mg/kg，異丙酚1.5 mg/kg，舒芬太尼0.5 μg/kg，羅庫溴銨0.8 mg/kg；術(shù)前15 min靜脈輸注帕瑞昔布納40 mg、托烷司瓊2 mg用以術(shù)后疼痛管理及預(yù)防術(shù)后惡心嘔吐。首先進(jìn)行離心探查，保護(hù)切口下結(jié)扎腫瘤上、下腸管，按照結(jié)直腸癌根治性原則實(shí)施結(jié)直腸全系膜切除術(shù)，將腫瘤上下腸管與結(jié)直腸全系膜一起切除，手術(shù)全程注意避免擠壓腫瘤瘤體，并在無瘤基礎(chǔ)上清掃系膜血管根部淋巴結(jié)[7]。用紗布多次擦凈組織開口處滲液，關(guān)腹縫合。

1.4方法

1.4.1SLC6A4基因多態(tài)性的檢測(cè) DNA提?。核惺茉嚮颊哂谌朐汉蟠稳涨宄靠崭共杉氨垤o脈血1～2 mL，采用DNA抽提試劑盒(DP304，天根)提取血液DNA，操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行；PCR擴(kuò)增：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)(PCR-RFLP)對(duì)SLC6A4基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)引物由上海生物技術(shù)工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，SLC6A4基因多態(tài)性目的片段特異性擴(kuò)增上游引物為5′-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3′，下游引物為5′-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3′。PCR反應(yīng)體系參照2×Taq PCR MasterMix試劑盒(RTC3104-03，中科瑞泰)說明書。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s設(shè)置40次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。HpaⅡ酶切檢測(cè)基因多態(tài)性：HpaⅡ限制性內(nèi)切酶購自上海莼試生物技術(shù)有限公司，酶切體系如下：BufferⅠ5 μL，PCR產(chǎn)物2 μL，去離子水加至20 μL，37 ℃水浴過夜。酶切產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因型多態(tài)性后再經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物長度為SA：469 bp；SG：402、469 bp；LA：512 bp；LG：402、110 bp。

1.4.2試驗(yàn)性疼痛評(píng)估 為保證患者安全，試驗(yàn)性疼痛通過便攜式壓力測(cè)試儀在本院內(nèi)設(shè)有搶救措施的房間內(nèi)完成。測(cè)試區(qū)域?yàn)榛颊哂仪氨蹆?nèi)側(cè)腕橫紋上2 cm處，通過壓力測(cè)試儀逐漸以1 kg/s勻速遞增的壓力刺激1 cm2固定測(cè)試區(qū)域。根據(jù)患者表述，記錄患者首次感覺到疼痛壓迫時(shí)的壓力數(shù)值，記為壓力痛閾(PPT)，以及患者感覺到疼痛無法耐受時(shí)的壓力數(shù)值為壓力耐痛閾(PTO)。重復(fù)3次測(cè)試，每次間隔30 min，計(jì)算并記錄均值。

1.4.3術(shù)后疼痛評(píng)估 術(shù)前教會(huì)所有患者正確使用VAS評(píng)分系統(tǒng)[8]，術(shù)后立即給予PCA：舒芬太尼1 μg/mL，總負(fù)荷量2 mL，輸注速度為1.5 mL/h，PCA劑量1 mL，鎖定10 min，最大劑量不超過12 mL/h。術(shù)后48 h內(nèi)通過VAS評(píng)分系統(tǒng)對(duì)患者手術(shù)后6、12、24及48 h疼痛程度進(jìn)行評(píng)分。

1.4.4不良反應(yīng)發(fā)生率 記錄患者術(shù)后48 h內(nèi)不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié) 果

2.1SLC6A4基因型檢測(cè) PCR產(chǎn)物經(jīng)HpaⅡ限制性內(nèi)切酶酶切并測(cè)序驗(yàn)證后呈現(xiàn)7種基因型，分別為：SA/SA 469 bp；SA/SG 469、402、67 bp；SA/LA 512、469 bp；SA/LG 469、402、110 bp；LA/LA 512 bp；LA/LG 512、402、110 bp；LG/LG 402、110 bp，見圖1。根據(jù)2種基因多態(tài)性對(duì)SLC6A4基因轉(zhuǎn)錄效率的影響，本研究將納入的3族患者基因表達(dá)情況各歸類為高表達(dá)5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT)(LA/LA)、中表達(dá)5-HTT(LA/LG、SA/LA)以及低表達(dá)5-HTT(SA/SA、LG/SG)3類。經(jīng)PCR-RFLP檢測(cè)維吾爾族、哈薩克族和漢族患者SLC6A4基因型和等位基因頻率，見表2，維吾爾族患者各基因型的表達(dá)頻率與漢族對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，維吾爾族患者與哈薩克族患者、哈薩克族患者與漢族患者各基因型表達(dá)頻率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.23個(gè)民族患者PPT及PTO比較 術(shù)前試驗(yàn)性疼痛檢測(cè)表明3個(gè)民族患者PPT值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，維吾爾族患者PTO值低于哈薩克族患者及漢族患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)分析組間SLC6A4基因型分布與PPT、PTO值間的關(guān)系，可以發(fā)現(xiàn)低表達(dá)5-HTT的患者PPT及PTO值均高于同組其他患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

注：1為SA/SA；2為SA/SG；3為SA/LA；4為SA/LG；5為LA/LA；6為LA/LG；7為LG/LG

圖1SLC6A4PCR產(chǎn)物酶切位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

表2 3組患者SLC6A4基因型和等位基因頻率

表3 3組患者術(shù)前試驗(yàn)性疼痛PPT和PTO比較

注：與維吾爾族比較,*P<0.05

表4 3組患者術(shù)后VAS評(píng)分及鎮(zhèn)痛不全比例的比較

2.33個(gè)民族患者術(shù)后VAS評(píng)分比較 維吾爾族患者術(shù)后6 h VAS評(píng)分高于哈薩克族患者和漢族患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3組患者術(shù)后12、24、48 h VAS評(píng)分間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如表4所示，每組患者攜帶SA/SA、LG/SG基因型，即低表達(dá)5-HTT的患者在術(shù)后6、12、24及48 h VAS評(píng)分均低于其他基因型患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4術(shù)后患者不良反應(yīng)發(fā)生率 3個(gè)民族患者術(shù)后不良反應(yīng)主要為惡心嘔吐、抽搐和呼吸抑制，經(jīng)PCA處理后均能耐受。維吾爾族、哈薩克族、漢族分別有13例(26%)、11例(22%)和11例(22%)患者發(fā)生不良反應(yīng)，3個(gè)民族患者間各類和總的不良反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 術(shù)后48 h內(nèi)3組患者不良反應(yīng)發(fā)生率[n(%)]

3 討 論

影響疼痛敏感性的因素是復(fù)雜的、多方面的，術(shù)后急性疼痛會(huì)危害患者的胃腸道、心肺、凝血及內(nèi)分泌等多種功能并誘發(fā)各種并發(fā)癥，危害患者的術(shù)后康復(fù)和心理狀態(tài)。人類編碼5-HTT的基因SLC6A4的表達(dá)水平近年來被證實(shí)與慢性疼痛綜合癥、熱痛閾值等密切相關(guān)[9]，5-HTT基因型低表達(dá)患者痛閾值更高在阿片類藥物的鎮(zhèn)痛治療中也顯示更好的治療效果[10-11]，其中5-HTT LPR和rs25531基因型是對(duì)5-HTT基因多態(tài)性研究的熱點(diǎn)，但對(duì)于SLC6A4基因多態(tài)性在漢族、哈薩克族及維吾爾族民族間的差異鮮有報(bào)道。因此本研究從試驗(yàn)性疼痛和術(shù)后疼痛2個(gè)方面，論證了新疆維吾爾族、哈薩克族和漢族患者疼痛敏感性與SLC6A4基因多態(tài)性之間的關(guān)系。

SLC6A4基因轉(zhuǎn)錄5-HTT LPR起始位點(diǎn)上游1kb的啟動(dòng)子區(qū)域存在的43 bp長度的堿基表達(dá)缺失與否，形成了S型或L型2種5-HTT等位基因片段，組成了常見的LL、LS和SS 3種基因型。以往的研究表明，等位基因S的表達(dá)會(huì)降低5-HTT的轉(zhuǎn)錄效率，減少細(xì)胞膜上5-HTT的富集，從而降低細(xì)胞對(duì)突觸間隙5-HT的重?cái)z取，促進(jìn)5-HT對(duì)后膜受體的結(jié)合和作用能力[12-13]。而rs25531是SLC6A4基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與5-HTT LPR連鎖遺傳的單核苷酸多態(tài)性(A>G)，同時(shí)G等位基因降低L等位基因的轉(zhuǎn)錄活性與S等位基因的作用幾乎一致[14]。分別提取維吾爾族、哈薩克族、漢族患者血液DNA檢測(cè)SLC6A4基因型分布，如圖1可以看到，SLC6A4基因PCR產(chǎn)物經(jīng)HpaⅡ限制性內(nèi)切酶酶切后共產(chǎn)生SA/SA、SA/SG、SA/LA、SA/LG、LA/LA、LA/LG、LG/LG 7種基因型，綜合上述兩2種基因多態(tài)性對(duì)SLC6A4基因轉(zhuǎn)錄效率的影響，本研究將所納入的患者基因表達(dá)情況歸類為高表達(dá)5-HTT(LA/LA)、中表達(dá)5-HTT(LA/LG、SA/LA)以及低表達(dá)5-HTT(SA/SA、LG/SG)3類。分析3組患者各基因型表達(dá)分布，如表2結(jié)果表明維吾爾族LA/LA、LA/LG、SA/LA基因型患者顯著多于SA/SA和LG/SG型患者，維吾爾族與哈薩克族、漢族患者基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過檢驗(yàn)試驗(yàn)性疼痛和患者術(shù)后疼痛程度分析3組患者疼痛敏感性與基因間關(guān)系，如表3所示，不同民族患者基因型表達(dá)差異對(duì)PPT無影響，維吾爾族患者PTO低于哈薩克族和漢族患者。同時(shí)，比較不同基因型患者PPT、PTO間差異，顯示低表達(dá)5-HTT基因型患者PPT和PTO高于同組表達(dá)其他基因型的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另一方面，前期研究報(bào)道，術(shù)后體內(nèi)麻醉藥物通過代謝排除體外的過程中，機(jī)體通過毛細(xì)血管吸收損傷壞死的組織并為修復(fù)提供材料，因此術(shù)后24 h內(nèi)痛感最為顯著，術(shù)后24～48 h疼痛漸弱[15]。因此，通過術(shù)后48 h內(nèi)各組患者VAS評(píng)分描述各組患者術(shù)后疼痛程度，由表4可知，3組患者術(shù)后6～48 h痛感逐漸減弱，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。同時(shí)，術(shù)后6 h維吾爾族患者VAS評(píng)分高于漢族和哈薩克族患者，哈薩克族患者與漢族患者間術(shù)后6 h VAS評(píng)分差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后12、24、48 h VAS評(píng)分各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；比較同組不同基因型患者術(shù)后VAS評(píng)分可知，低表達(dá)5-HTT的SA/SA、LG/SG基因型患者術(shù)后各時(shí)間段VAS評(píng)分均低于同組其他基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)比較3組患者術(shù)后不良反應(yīng)發(fā)生率，3組患者均有不同程度的不良反應(yīng)發(fā)生，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過對(duì)癥處理后所有患者不良反應(yīng)均可耐受。

疼痛是當(dāng)組織器官受損時(shí)，物理和化學(xué)炎癥因子刺激或激活外周末梢神經(jīng)上的傷害性感受器，從而傳導(dǎo)出疼痛的神經(jīng)沖動(dòng)，形成的生理過程。早前研究表明，5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)在疼痛傳導(dǎo)、疼痛敏感性中發(fā)揮重要作用，5-HT在組織受損后被作為致痛因子釋放并作用于脊髓背角相應(yīng)受體，在疼痛下行抑制通路上發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，提高傷害反應(yīng)的閾值[16-17]。而5-HT在突觸間隙的含量主要受5-HTT對(duì)其再攝取能力的影響。高表達(dá)5-HTT的基因型個(gè)體對(duì)5-HT再攝取增加，游離的5-HT含量降低相應(yīng)5-HT1A/2A信號(hào)通路收到抑制，疼痛下行抑制系統(tǒng)能力隨之減弱增加患者主觀痛感[18]。這與本研究中高表達(dá)5-HTT基因型的維吾爾族患者個(gè)體具有較低的PPT、PTO和較高的VAS評(píng)分結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究初步探討了SLC6A4基因多態(tài)性與新疆地區(qū)維吾爾族、哈薩克族和漢族民族間疼痛敏感性具有相關(guān)性，含有S、G等位基因的個(gè)體具有較高的痛閾及耐痛閾。但與此同時(shí)，鎮(zhèn)痛藥物對(duì)不同民族或患者的鎮(zhèn)痛效果存在的個(gè)體差異也不能被忽視，因此，本研究仍需進(jìn)一步大樣本、多地區(qū)的研究與驗(yàn)證，最終為本地區(qū)實(shí)現(xiàn)個(gè)體化診療，輔助患者預(yù)后提供可靠的數(shù)據(jù)和理論支持。