酶聯(lián)免疫斑點試驗在脊柱結核輔助診斷應用中的影響因素探討

袁 凱，張順聰△，周騰鵬，馬延懷，梁 德，吳雪瓊，陳建庭

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱?？疲瑥V東廣州 510405；2.中國人民解放軍三○九醫(yī)院全軍結核病研究所全軍結核病防治重點實驗室，北京 100091；3.南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院脊柱專科，廣東廣州 510515)

結核病目前是全世界范圍內最廣泛流行的傳染病之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)報告2015年全世界范圍內共約1 000萬人口確診感染結核[1]。骨與關節(jié)結核是由于結核分枝桿菌侵蝕骨與關節(jié)而引起的破壞性病變，脊柱是最常好發(fā)的部位[2]。實驗室檢查在脊柱結核的早期輔助診斷中發(fā)揮著重要作用。酶聯(lián)免疫斑點試驗技術(ELISPOT)在診斷結核病感染方面發(fā)揮了重要作用[3]。結核感染T細胞斑點試驗在脊柱結核輔助診斷中有著良好的靈敏度和特異度[4]。應用ELISPOT技術診斷活動性結核感染過程中，由于結核患者的不同機體功能狀態(tài)及體內細胞免疫功能差異，其診斷率受多種臨床因素的影響[5]。本研究旨在探討在脊柱結核輔助診斷中，CFP-10/ESAT-6蛋白的ELISPOT技術的應用價值及臨床影響因素。

1 資料與方法

1.1一般資料 從2015年1月至2017年10月期間本課題組共前瞻性納入可疑脊柱結核病例156例(患者就診于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科和南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院脊柱?？?。最終經臨床診斷為新發(fā)脊柱結核的患者共85例。脊柱結核組(病例組)中，男45例，女40例，年齡5～85歲，平均(41.3±20.5)歲，病程1～13個月，平均(7.3±3.2)個月。病變累及部位：頸胸交界區(qū)7例，胸椎25例，胸腰段15例，腰椎29例，腰骶段9例，其中共有43例合并明顯椎旁膿腫。非脊柱結核疾病組共71例(對照組)，其中男32例，女39例，年齡15～72歲，平均(45.5±15.9)歲。診斷為腰椎間盤突出癥22例、頸椎病15例、化膿性脊柱炎6例，脊柱轉移瘤例16例，椎管內腫瘤12例。病例組納入標準[6]：(1)經影像學和病灶標本病理檢查確診結核改變；(2)入院前抗結核治療時間<2周；(3)患者病灶菌種經鑒定排除非結核分枝桿菌的感染；(4)無人類免疫缺陷病毒(HIV)感染。對照組納入標準：(1)無結核感染征象；(2)經影像學評估無結核感染特征；(3)3個月內無與活動性結核感染患者接觸史；(4)無HIV感染。排除標準：其他部位出現結核的患者。本研究經過醫(yī)院倫理委員會的批準，受試者均簽訂項目知情同意書。

1.2方法 所納入受試者均抽取3～5 mL外周靜脈抗凝血，分離，提取，進一步制備濃度為2.5×106/L單核細胞懸液。試驗所用CFP-10/ESAT-6融合蛋白由解放軍三○九醫(yī)院結核病研究所提供。ELISPOT具體試驗流程參照課題組前期方法[7]。將細胞培養(yǎng)液，陽性對照PHA、特異性融合抗原分別加入到3個檢測孔(空白對照孔、陽性對照孔、檢測孔)，然后在上述孔內分別加入分離的單細胞懸液，置于37 ℃含5% CO2孵箱中孵育20 h。洗板后，加入配制的檢測抗體，37 ℃孵育1 h；再次洗板后，加入鏈親和素-堿性磷酸酶100 μL；最后一次洗板后，加入配制的BICP/NBT底物，顯色15 min。在孔內可看到有藍色斑點形成。其他儀器設備包括:CO2孵育箱(Heraeus公司，德國)，微量移液器(Eppendorf公司，德國)，96孔細胞培養(yǎng)板：MILIPOR公司，美國)，用于檢測計數著色的斑點形成細胞(SFC)的酶聯(lián)斑點分析儀(CTL公司，美國)。檢測當日實驗室溫度、濕度符合本試驗要求。

1.3ELISPOT結果判斷 根據前期實驗受試者工作特征曲線(ROC曲線)的陽性閾值[7]，結果判斷參照以下標準：若空白對照孔斑點小于17，檢測孔斑點數減去空白對照孔斑點數不低于17，結果為“陽性”；若空白對照孔斑點數不低于17，檢測孔斑點數不低于空白對照孔斑點數的2倍，結果為“陽性”。陰性標準為：上述標準不符合，且陽性對照孔正常。

2 結 果

2.1各組間ELISPOT的診斷率 在最終臨床確診的85例脊柱結核患者中，ELISPOT診斷的陽性率為83.5%。病例組中SFC數量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2病例組ELISPOT檢測結果與臨床相關因素分析 納入臨床確診的85例脊柱結核患者中，ELISPOT診斷在老年脊柱結核患者(年齡≥ 60歲)中的陽性率低于年齡<60歲的患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但兩組間SFC數量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。身體質量指數(BMI)≤16 kg/m2的脊柱結核患者SFC數量低于BMI 17～25 kg/m2組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但兩組間ELISPOT診斷陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；脊柱結核同時合并有椎旁膿腫組的SFC數量高于單純椎體破壞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但兩組間ELISPOT診斷陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 病例組和對照組ELISPOT檢測效果

表2 病例組ELISPOT試驗與臨床因素的相關性

注：a為獨立樣本t檢驗用于比較不同臨床亞組間SFC數量，b為χ2檢驗用于比較不同臨床亞組間陽性率

2.3病倒組中ELISPOT假陰性結果可能原因 在確診的85例脊柱結核患者中，有14例患者ELISPOT結果呈假陰性改變。其中男8例，女6例，年齡34～76歲，其中10例患者有合并癥，且7例合并風濕免疫系統(tǒng)疾患者(3例系統(tǒng)性紅斑狼瘡、3例類風濕性關節(jié)炎、1例強直性脊柱炎)在接受ELISPOT檢測前均應用了相關免疫抑制劑系統(tǒng)治療3個月以上。6例脊柱結核患者淋巴細胞數量較正常值明顯減少，其淋巴細胞平均值為(725±81)個/微升，CD4+T淋巴細胞為(355±23)個/微升。

3 討 論

脊柱結核為繼發(fā)性疾病，絕大部分患者在結核分枝桿菌感染機體后，經血液循環(huán)途徑出現脊柱椎體或者附件結構感染病變[8]。早期常見癥狀一般是病變椎體部位疼痛，病情發(fā)展緩慢，影像學特點不典型。隨著病情的演變，脊柱結核患者病灶可能致使椎體破壞進一步加重，并波及椎管內脊髓、神經組織，造成嚴重的臨床后果。在本研究中病程超過6個月的患者占到全部病例的2/3，部分患者已出現雙下肢麻痛，活動受限甚至截癱的狀況。因此，如何在早期實現對脊柱結核的診斷，并進行干預治療，顯得非常重要。已有研究證實，ELISPOT因其良好的靈敏度和特異度，在肺結核和肺外結核輔助診斷中取得了一定效果[9-11]。課題組前期將該項技術應用于脊柱結核輔助診斷中，相比傳統(tǒng)實驗室檢查取得了良好的診斷效率[7]。本次研究中，ELISPOT技術在可疑脊柱結核診斷中的陽性率為83.5%，這同文獻報道的結果基本一致[6]。

既往研究表明，當結核分枝桿菌感染人體時，細胞免疫應答發(fā)揮著重要作用[12]，結核分枝桿菌被巨噬細胞吞噬后成為特異性抗原肽，然后通過抗原提呈細胞遞呈給T細胞，特異性CD4+T細胞接受其刺激后產生γ-干擾素[13]。由于結核感染個體細胞免疫受多方面影響，γ-干擾素釋放試驗的最終結果也會受到疾病個體各種臨床因素的影響[14]。有文獻報道，年齡的增長可能是導致ELISPOT結果假陰性的一個重要因素[15-16]，不過上述研究都是基于肺結核病例的探討，關于肺外結核，脊柱結核的相關數據是相對缺乏的。本研究通過對不同年齡段脊柱結核患者分組研究，得出在年齡≥ 60歲的老年脊柱結核患者中ELISPOT診斷陽性率顯著低于年齡<60歲組患者，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這在一定程度上說明，在脊柱結核輔助診斷中，年齡的增長與ELISPOT結果有著密切聯(lián)系。中國是一個人口大國，即將迎來人口老齡化的時代，結核病在老齡人口中的發(fā)病率已經超過年輕人，脊柱結核發(fā)病也呈現老齡化趨勢，這部分患者同時還可能合并有其他并發(fā)癥，加大了診療難度[17]。因此，提示醫(yī)務工作者在應用ELISPOT技術診斷這部分疑似結核患者時，需要充分考慮年齡的影響因素。

本次研究發(fā)現BMI偏低的脊柱結核患者SFC數量低于BMI 17～25 kg/m2組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同樣，國內學者薛芳芳等[18]通過對47例結核性胸膜炎患者外周血進行檢測，認為BMI是影響T-SPOT.TB結果的一個獨立危險因素?？季科湓?，體質量過輕、營養(yǎng)狀況偏差可能會抑制患者的免疫應答功能[17]。這種不健康的身體狀況會減弱結核特性抗原的反應程度，從而出現假陰性的結果。然而本研究不同BMI組間，總體ELISPOT陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由于本次研究納入低BMI患者的例數有限，后期仍需要通過進一步加大樣本量繼續(xù)驗證。

本研究進一步探討發(fā)現，合并椎旁膿腫的脊柱結核患者SFC數量顯著高于單純椎體破壞改變無椎旁膿腫的患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。椎旁膿腫是脊柱結核一種常見的并發(fā)癥，形成過程較為緩慢，膿腫出現時意味著疾病發(fā)展到相對嚴重的地步。此時，脊柱結核患者機體內環(huán)境及宿主免疫力發(fā)生了顯著改變，體內細胞免疫應答機制及相關基因的調控作用更為顯著[19]。同時結核分枝桿菌感染的過程與相關抗原的高表達、較強的免疫應答密切相關[20]。

本次研究中85例脊柱結核組患者中有14例ELISPOT的結果呈假陰性，假陰性率為16.5%。這個同文獻報道的檢測指標假陰性率范圍是一致的(5%～20%)[17]，但目前文獻數據大部分是基于肺結核病例，關于脊柱結核病例的相關數據是缺乏的。通過對本組假陰性病例進一步研究發(fā)現，有6例脊柱結核患者淋巴細胞數量較正常值明顯減少，其淋巴細胞平均值為(725±81)個/微升，CD4+T淋巴細胞為(355±23)個/微升。LEE等[10]在對結核性胸膜炎患者外周血應用ELISPOT技術檢測時同樣發(fā)現，此類合并淋巴細胞減少癥的結核患者結果呈假陰性改變，推測γ干擾素的分泌可能受機體外周血T淋巴細胞數目的影響。同時，關于檢測前免疫抑制劑的應用是否對ELISPOT結果會產生影響，目前也有部分研究。LIAO等[16]認為T淋巴細胞γ-干擾素的分泌會受到免疫抑制劑的干擾，從而在一定程度上影響ELISPOT的診斷陽性率。本次研究ELISPOT結果呈假陰性的病例中，有7例脊柱結核患者由于同時合并風濕免疫性疾病，檢測前均接受了不同程度皮質類固醇和免疫抑制劑的治療，但不確定其究竟是不是獨立影響因素。由于這部分病例較少，無法分亞組繼續(xù)開展討論，本研究擬下一步通過多中心、大樣本研究，驗證ELISPOT技術在合并免疫功能缺陷的脊柱結核輔助診斷中的應用價值，進一步驗證其可靠性。

4 結 論

在脊柱結核的實驗室輔助診斷中，以結核分枝桿菌特異性融合抗原CFP-10/ESAT-6作為刺激物ELISPOT試驗發(fā)揮著一定作用，其診斷結果可能受到年齡、BMI、椎旁膿腫等臨床因素影響。實際臨床診療過程中應充分考慮上述因素影響，盡可能減少漏診。