產(chǎn)ESBL及非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌整合子分布差異與耐藥性分析

徐令清,朱卓均,湯英賢,溫偉洪,李玉珍,鐘國權,王 歡,李介華

(廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院/清遠市人民醫(yī)院檢驗科，廣東清遠 511518)

大腸埃希菌是腸道內(nèi)重要的正常菌群，當機體抵抗力低下或細菌侵入腸道外組織器官后，可引起相關疾病，如敗血癥、尿路感染、肺炎等[1]。近年來，大腸埃希菌的耐藥性逐步增加，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是其耐藥的主要機制，ESBLs存在多種基因型,各個國家和地區(qū)流行的種類各不相同[1]。ESBLs是一種水解青霉素、頭孢菌素及單胺類的酶。ESBLs陽性的菌株不僅對β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物耐藥,且對其他抗菌藥物耐藥嚴重,給臨床用藥帶來諸多不便[2]。整合子作為一種可移動的基因元件，不僅可利用位點特異性重組系統(tǒng)在細菌之間傳播，并且具有捕獲耐藥基因盒的功能[3]。本文通過基因擴增和測序的方法研究整合子在產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌中的分布和整合子攜帶耐藥基因盒的種類。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院從2018年1月至2018年8月臨床標本分離出的大腸埃希菌89株，質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923以及大腸埃希菌ATCC25922。89株大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs菌株49株，非產(chǎn)ESBLs菌株40株。排除同一患者在一次住院期間同類型標本分離的同種菌株。其中尿液43株，傷口分泌物9株，血液7株，痰液、膿液、分泌物、引流液、膽汁等其他標本30株。

1.2儀器與試劑 細菌鑒定以及藥敏試驗使用BD phoenix100(美國BD公司)全自動細菌鑒定儀及其配套鑒定藥敏卡；分離培養(yǎng)基采用哥倫比亞血瓊脂平板(廣州市迪景微生物科技有限公司)；提取核酸時采用細菌DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司TIANGEN)；擴增、電泳儀器及結果分析使用S1000TMPCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)、Power PacTMBasic 電泳儀(美國BIO-RAD公司)以及Gel DoxTMXR+紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，試劑選用天根科技有限公司(TIANGEN)生產(chǎn)的Taq PCR MasterMix，GelRed核酸染料以及Marker Ⅱ、Ⅲ DNA Ladder 成品；引物由英駿生物技術有限公司合成。

1.3方法

1.3.1細菌總DNA 提取 臨床分離菌株經(jīng)無菌純牛奶-80 ℃冷凍保存，于使用前復蘇，使用哥倫比亞血平板分離過夜培養(yǎng)，挑取適量菌量加入無菌生理鹽水中懸浮備用；按照TIANGEN公司細菌組DNA提取試劑盒說明書的步驟提取，將最后洗脫后的DNA產(chǎn)物至于1.5 mL規(guī)格的無菌EP管中，-80 ℃冷凍保存。

1.3.2引物設計 參照參考文獻[5-6]，Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類整合子的整合酶基因和可變區(qū)所用的引物序列見表1。

1.3.3整合酶基因PCR 檢測 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子 PCR反應體系[4]為：2×Taq PCR masterMix 12.5 μL，其中包含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液等，上下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL(濃度統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL)，補充ddH2O至25 μL；反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，以100～1 200 bp的MarkerⅡ DNA Ladder作為條帶參照，電壓為80 V，取5 μL產(chǎn)物點樣在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳60 min，使用BIO-RAD公司的凝膠成像系統(tǒng)分析并處理結果。

1.3.4可變區(qū)PCR檢測 整合子可變區(qū)PCR反應體系[4]為：2×Taq PCR masterMix 25 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL(濃度統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL)，補充ddH2O至50 μL；反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，以200～4 500 bp的MarkerⅢ DNA Ladder作為條帶參照，電壓為80 V，取5 μL產(chǎn)物點樣在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳60 min，使用BIO-RAD公司的凝膠成像系統(tǒng)分析并處理結果。

表1 3類整合酶基因以及可變區(qū)引物序列

1.3.5可變區(qū)測序分析 可變區(qū)PCR檢測后，電泳結果顯示有明顯條帶的產(chǎn)物交由上海生物工程有限公司進行純化和測序分析，測序圖譜結果使用Chromas軟件進行序列拼接校正，使用BLAST(www.pubmed.com)進行序列比對分析，選擇匹配度最高的結果。

1.4統(tǒng)計學處理 藥敏結果使用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，耐藥率的比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1科室分布情況 49株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌菌株中，送檢自泌尿外科的有8株；其次是胃腸外科7株、肝膽外科6株以及重癥監(jiān)護室(ICU)和婦科各5株，其余科室散發(fā)存在；40株非產(chǎn)ESBLs菌株中，泌尿外科12株，其次是肝膽外科8株，其他科室散發(fā)存在。

2.2整合酶基因分布 89株肺大腸埃希菌共檢出Ⅰ類整合子陽性菌株36株，檢出率為40.4%；其中產(chǎn)ESBLs菌株中占49.0%(24/49)，非產(chǎn)ESBLs菌株中占30%(12/40)；未檢出Ⅱ類和Ⅲ類整合子。部分Ⅰ類整合子陽性PCR電泳結果如圖1所示。

2.3Ⅰ類整合子與各種抗菌藥物耐藥率的關系 Ⅰ類整合子陽性的菌株對各類抗菌藥物的耐藥率除阿米卡星、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和美羅培南之外均高過Ⅰ類整合子陰性的菌株。見表2。

2.4整合子可變區(qū)擴增結果 經(jīng)過PCR擴增以及瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)明顯條帶的標本有15株，其片段長度為800～2 000 bp之間，大小不等。見圖2。

注：Marker為100～1 200 bp；泳道1～9為Ⅰ類整合酶基因陽性標本，對應的原始編號為2、6、8、9、10、11、12、16、17；泳道10為空白對照

圖1部分Ⅰ類整合酶基因PCR擴增結果

注：M為Marker；泳道1～15分別為6、8、10、11、12、16、20、30、32、35、39、42、71、77、79菌株；16為空白對照

圖215株陽性標本可變區(qū)PCR結果

2.5基因盒測序結果 結合瓊脂糖凝膠電泳條帶分析，把15株可變區(qū)陽性菌株送去測序。測序結果顯示，15株可變區(qū)陽性的菌株全部檢測出基因盒。其攜帶的基因盒類型如表3及圖3所示，共檢出5種耐藥基因。

表2 89株大腸埃希菌Ⅰ類整合子陽性菌株和Ⅰ類整合子陰性菌株的耐藥表型比較(%)

續(xù)表2 89株大腸埃希菌Ⅰ類整合子陽性菌株和Ⅰ類整合子陰性菌株的耐藥表型比較(%)

注：-表示無數(shù)據(jù)

表3 耐藥表型與可變區(qū)基因盒組合比較

注：對20種抗菌藥物進行分類，可以分為9類，其中a類為碳青酶稀類，亞胺培南、美羅培南；b類為氨基糖苷類，慶大霉素、阿米卡星；c類為喹諾酮類，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星；d類為頭孢菌素類，頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟；e類為廣譜青霉素類，氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林；f類為β-內(nèi)酰胺類，氨曲南、氨芐青霉素；g為磺胺類，復方新諾明；h為四環(huán)素類，四環(huán)素；i為酰胺醇類，氯霉素；-表示無數(shù)據(jù)

圖3 本次檢出整合子結構圖

3 討 論

根據(jù)近年來中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)報告，大腸埃希菌是臨床分離的最常見的病原體之一[6]。近年來，臨床大量使用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，導致產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌逐漸增多。ESBLs可由質(zhì)粒介導，通過接合、轉化、轉導、整合子等使耐藥基因在同種屬或不同種屬間細菌進行傳遞，給臨床治療帶來較大困難。

整合子廣泛存在于革蘭陰性菌中，其與細菌耐藥性密切相關[7]。因此本次研究對臨床分離的產(chǎn)ESBLs及非產(chǎn)ESBLs的89株大腸埃希菌進行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子、可變區(qū)分析，從而對本院ESBLs大腸埃希菌的耐藥情況以及院內(nèi)感染趨勢提供相應的依據(jù)。通過Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的檢測發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類整合子陽性共36株，檢出率為40.4%；其中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的Ⅰ類整合子陽性檢出率為49.0%，非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的Ⅰ類整合子陽性檢出率為30%；并未檢出Ⅱ、Ⅲ類整合子；由此可見，Ⅰ類整合子在產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌中的分布差異較為明顯。另外，本次實驗還發(fā)現(xiàn)來自胃腸外科的7株產(chǎn)ESBLs菌株中，有4株檢測出Ⅰ類整合子陽性，檢出率為57.1%；另來自胃腸外科的4株非產(chǎn)ESBLs的菌株中，均未檢測出Ⅰ類整合子，與前者存在明顯的差異。

通過統(tǒng)計分析，氨芐青霉素的耐藥率為100%，阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率較低，均在10%以下，而本次實驗所用到的89株大腸埃希菌，亞胺培南、美羅培南以及阿米卡星為全敏感，與相關文獻報道基本一致[7]，提示臨床可以根據(jù)患者感染情況按照限制級別選擇用藥；對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、哌拉西林、頭孢噻肟、氨曲南、復方新諾明和氯霉素等藥物，Ⅰ類整合子陽性菌株的耐藥率明顯高于陰性菌株，這代表著其耐藥機制與Ⅰ類整合子存在緊密聯(lián)系。

整合子是一種重要的耐藥基因捕獲及傳播元件，可位于染色體、質(zhì)粒或轉座子上，攜帶一個或多個與抗菌藥物和消毒劑抗性有關的基因盒的遺傳單位；基本結構有5′保守區(qū)(5′CS)、3′保守區(qū)(3′CS)、可變區(qū)(VR)3個部分組成?？勺儏^(qū)可同時插入一個或多個基因盒，基因盒是由重組位點attC和基因編碼區(qū)組成，這些基因盒作為獨立的功能單位可單獨移動[8-9]。整合子可分為抗性整合子和超級整合子兩大類?？剐哉献影凑厦竔ntI序列同源性差別分成6類。國外研究表明，臨床耐藥菌中整合子普遍存在，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子與細菌耐藥性相關[10-12]，其攜帶的耐藥基因盒所編碼的產(chǎn)物幾乎能對抗臨床上大多數(shù)抗菌藥物，整合子陽性株對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率高于整合子陰性菌株[13-14]。

在本研究中只檢測到Ⅰ類整合子，未檢測到Ⅱ、Ⅲ類，整合子陽性菌株其耐藥性顯著高于整合子陰性菌株，與文獻報道相符[15-16]。89株大腸埃希菌中擴增出可變區(qū)的有15株，共檢出5種耐藥基因盒。其中aadA22、aadA2、aadA5為編碼氨基糖苷類藥物的耐藥基因[15];dfrA12、dfrA17為編碼磺胺類藥物的耐藥基因[17]，本次檢測的耐藥基因與耐藥表型有一定關聯(lián)卻沒有完全相符，可能還存在其它耐藥機制，需進一步研究。

綜上所述，Ⅰ類整合子的攜帶與細菌的耐藥性有著密切的聯(lián)系，其可變區(qū)所攜帶的基因盒具有多樣性，與耐藥機制有一定的對應關系。應加強研究，以更深入地了解細菌耐藥的發(fā)生和傳播,為醫(yī)院感染的流行和傳播及選用抗菌藥物提供依據(jù)。

4 結 論

Ⅰ類整合子在ESBLs和非產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌中的分布存在較為明顯的差異，且與耐藥表型存在一定的相關性，顯示其與細菌的耐藥性關系緊密，應予以足夠重視。