精漿ROS、PON-1、MDA聯(lián)合精子DNA碎片指數(shù)在男性不育癥患者中的研究

劉利敏,謝慶東,凌曉輝,余 相,陳志云

(1.惠州市中心人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,廣東惠州 516001;2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心,廣東汕頭 515041)

男性不育癥是指夫妻雙方未采取任何避孕措施，規(guī)律性生活1年以上，因男方因素導(dǎo)致女方未自然受孕。男性不育癥發(fā)病因素多樣，約70%的患者難找到發(fā)病原因[1]。

氧化應(yīng)激條件下，機(jī)體常常會產(chǎn)生高活性分子，如活性氧(ROS)，其可引起機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物損傷，從而引起男性不育癥[2]。對氧磷酶-1(PON-1)為機(jī)體內(nèi)非常重要的抗氧化酶，其活性降低亦可導(dǎo)致不育[3]。丙二醛(MDA)是ROS的脂質(zhì)過氧化醛式產(chǎn)物，可損傷精子的細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致不育[2]。精子DNA的完整性和DNA碎片指數(shù)(DFI)是判斷精子DNA損傷的重要指標(biāo)，精子DNA的損傷可導(dǎo)致男性不育[4]。

本研究通過分析男性不育癥患者的精漿ROS、PON-1、MDA和精子DFI水平，以期為男性不育癥的診斷及治療提供一些臨床依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年6月至2018年6月在惠州市中心人民醫(yī)院就診的50例男性不育癥患者納入試驗(yàn)組，年齡22～40歲，平均(26.32±4.13)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)婚后正常性生活，未避孕1年以上不育，明確診斷為男性不育癥；(2)無睪丸外傷、性腺不全、性功能障礙及家族遺傳性疾病等；(3)體檢無明顯睪丸、附睪和輸精管異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有嚴(yán)重的心血管、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等；(2)睪丸和睪丸后因素而導(dǎo)致的不育者；(3)患有外傷或者感染疾病。對照組的精液來自二胎孕前檢查者50例，年齡21～39歲，平均(28.42±2.75)歲。

1.2試驗(yàn)方法 (1)精液采集：按照《WH人類精液檢查和處理實(shí)驗(yàn)室手冊》的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液采集：受試者在標(biāo)本采集前禁欲2～7 d，手淫法采集精液，置無菌采精杯中，立即送男性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行精液常規(guī)、精漿ROS、PON-1、MDA和精子DFI檢測。(2)精液常規(guī)檢查：精液液化后，觀察精液顏色，檢測精液量，使用西班牙SCA精液分析系統(tǒng)進(jìn)行精子濃度、精子存活率及前向運(yùn)動精子率等檢查。(3)ROS、PON-1、MDA檢測：將患者精液離心，獲取精漿，分別置不同的試管中進(jìn)行檢測。ROS檢測使用ELISA法，試劑盒購自上海欣樂生物有限公司；PON-1檢測使用分光光度法，試劑盒購自上海希美生物科技有限公司；MDA檢測使用硫代巴比妥酸法，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。(4)精子DFI檢測：精子染色質(zhì)擴(kuò)散法，試劑盒購自深圳市博銳德生物科技有限公司。按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，光學(xué)顯微鏡下觀察比較至少500個精子的精子核和核周暈輪，計(jì)算DFI。

2 結(jié) 論

2.1兩組精液常規(guī)檢查結(jié)果比較 與對照組比較，試驗(yàn)組患者精子濃度、精子存活率及前向運(yùn)動精子率均明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，精液量兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者精液常規(guī)檢查結(jié)果比較

2.2兩組患者精漿ROS、PON-1、MDA和精子DFI比較 與對照組比較，試驗(yàn)組精漿ROS、MDA和精子DFI顯著升高，精漿PON-1水平明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 男性不育癥患者精漿ROS、PON-1、MDA與精子DFI的相關(guān)性分析圖

組別n精漿ROS(U/L)精漿MDA(nmoL/mL)精漿PON-1(U/mL)精子DFI(%)對照組50463.91±167.585.75±1.184.02±0.6913.05±5.54試驗(yàn)組50736.33±247.5816.00±4.241.25±0.2537.76±6.43P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.3男性不育癥患者精漿ROS、PON-1、MDA與精子DFI的相關(guān)性分析 男性不育癥患者精漿ROS水平與精子DFI之間呈正相關(guān)(r=0.538，P<0.05)，精漿MDA水平與精子DFI之間呈正相關(guān)(r=0.737，P<0.05)，精漿PON-1與精子DFI之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.371，P<0.05)。見圖1。

3 討 論

近年來，不孕不育率呈逐年上升的趨勢，其中男性因素導(dǎo)致不育的概率約50%。男性不育癥對家庭和諧造成嚴(yán)重影響，而引起男性不育癥的因素多種多樣，其中較為常見的原因?yàn)榫寒惓?。因此，有效評估精液的質(zhì)量對于不育癥的診斷及預(yù)后非常重要。目前絕大多數(shù)男性不育癥患者仍然依靠精液常規(guī)檢查，但是精液常規(guī)檢查亦存在一定的缺陷，一部分精液常規(guī)檢查各項(xiàng)參數(shù)及精子形態(tài)學(xué)正常的男性，仍出現(xiàn)不育情況。故尋求新的更準(zhǔn)確、更全面的方法或者生物學(xué)指標(biāo)，對于男性不育癥的診斷和預(yù)后具有極其重要的意義[5-6]。

在精子的形成過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)極易對精子造成損害。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的ROS可以使精子細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成的脂質(zhì)過氧化物可導(dǎo)致精子的形態(tài)學(xué)、功能和代謝發(fā)生異常。同時，ROS還可以通過影響精子核酸及蛋白質(zhì)的異常，從而破壞精子DNA的完整性，引起精子DNA碎片指數(shù)升高，繼而導(dǎo)致不育[7-8]。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者精漿ROS水平較對照組明顯升高，ROS水平與精子DFI呈正相關(guān)(r=0.851，P<0.05)，這表明不育癥男性的精子可發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致精子DNA碎片增加，這可能與精子細(xì)胞膜蛋白質(zhì)受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。

PON是由肝臟產(chǎn)生的一種酶，常存在于高密度脂蛋白中，有PON-1、PON-2和PON-3 3種亞型。3種亞型中的PON-1為機(jī)體內(nèi)對抗氧化反應(yīng)的重要磷酸酯酶，通過與高密度脂蛋白中的ApoA1結(jié)合，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的聚集而達(dá)到抗氧化作用。已有研究證實(shí)，PON-1的活性降低可降低精子數(shù)量，改變精子形態(tài)和活動力，是男性不育癥的重要危險(xiǎn)因素[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗(yàn)組患者精漿PON-1水平明顯下降，PON-1水平與精子DFI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.753，P<0.05)，這表明不育癥男性的精子抗氧化反應(yīng)作用減弱，導(dǎo)致精子DNA碎片增加，這可能與精子細(xì)胞膜ROS產(chǎn)量增加，PON-1的消耗增多，氧化/抗氧化系統(tǒng)的失衡有關(guān)。

MDA是機(jī)體細(xì)胞膜多聚不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性作用，可破壞精子細(xì)胞膜的完整性和流動性，導(dǎo)致精子的運(yùn)動能力下降或者喪失，從而影響受孕能力。研究表明，MDA可影響精液常規(guī)參數(shù)，也可使精子活力喪失，在男性不育癥中發(fā)揮著重要作用[11]。本文研究揭示，試驗(yàn)組患者精漿MDA水平較對照組明顯升高，MDA水平與精子DFI呈正相關(guān)(r=0.623，P<0.05)，與ROS水平的升高趨勢一致，這與甄錦壯等[12]和季興哲等[13]的研究結(jié)果一致，提示精漿MDA能夠間接反映精漿ROS的活性和精子DNA的損傷程度。

精子DNA是人體遺傳信息的攜帶者，其基因突變、缺失、含量改變等均可導(dǎo)致DNA的完整性受到損傷，從而影響受精和胚胎發(fā)育。已有不少研究表明，精子DNA損傷與男性不育癥有著密切的關(guān)系，可影響精子的存活率和濃度[14]。因此，近年來，對于判斷精子DNA損傷標(biāo)準(zhǔn)的DFI在男性不育癥中的作用越來越得到重視，逐漸成為生殖醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。本文研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者精子DFI較對照組明顯升高，這驗(yàn)證了男性不育癥患者中DNA損傷的存在。

4 結(jié) 論

男性不育癥患者精子濃度、精子存活率及前向運(yùn)動精子率均明顯降低，精漿ROS、MDA和精子DFI顯著升高，精漿PON-1水平明顯降低，精漿ROS、MDA水平與精子DFI之間呈正相關(guān)，精漿PON-1與精子DFI之間呈負(fù)相關(guān)。因此，精漿ROS、PON-1、MDA水平和精子DFI的檢測可以為男性不育癥的診斷和治療提供依據(jù)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。