Th22細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫炎性反應中的作用機制研究

梁 華,邱明亮,李曉芳,楊軍平,周愛明,肖 亮,楊建安,劉 意

(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院:1.檢驗科;2.風濕病科;3.藥劑科，江西南昌 330006)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種典型的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，目前SLE的發(fā)病機制尚不明確，而免疫調(diào)節(jié)異常則是該病發(fā)生、發(fā)展的重要因素，患者體內(nèi)T細胞亞群比例失衡，各亞群典型細胞因子分泌水平出現(xiàn)紊亂。T淋巴細胞(Th)22細胞是EYERICH等[1]在2009年新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞功能亞群，它獨立于Th1、Th2和Th17，不分泌γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-4、IL-17，而IL-22則是Th22細胞分泌的最主要的細胞因子，其功能主要通過IL-22來實現(xiàn)，芳香烴受體(AhR)是其關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。既往研究表明，Th22細胞可能在皮膚的自穩(wěn)調(diào)節(jié)和病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，同時，Th22細胞在監(jiān)督和協(xié)調(diào)引起炎癥的免疫細胞過程中起特殊的作用，但Th22細胞在SLE患者中是否存在表達異常及其與狼瘡活動和器官損害的關(guān)系尚未得到確認。為深入探討Th22細胞在SLE免疫炎性反應中的作用機制，筆者對SLE患者全血中Th22細胞的頻率、外周血清IL-22的水平及其關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AhR mRNA的表達水平進行了系統(tǒng)研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年9月至2016年8月江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院風濕科、皮膚科SLE患者46例，其中男6例，女40例，平均年齡(34.5±11.2)歲，診斷均符合1997年美國風濕學會(ACR)修訂的SLE分類診斷標準。疾病活動度采用疾病活動指數(shù)(SLEDAI)-2000評分系統(tǒng)進行評估，根據(jù)臨床表現(xiàn)和實驗室指標判斷，SLEDAI>5歸入活動期SLE患者組，SLEDAI<5歸入非活動期SLE患者組，但若同時患有以下疾病將從受試者中排除：(1)同時患有除SLE以外的其他自身免疫性疾?。?2)惡性腫瘤；(3)肝臟疾?。?4)其他感染性疾病等；同期選取江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院健康體檢人員36例作為對照組，其中男3例，女33例，平均年齡(32.2±10.4)歲，所有健康體檢人員肝腎功能、血尿常規(guī)正常，均無上述所列各類疾病且年齡和性別與活動期SLE患者組及非活動期SLE患者組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，本研究方案經(jīng)江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均于采血前簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 FACS Calibur型流式細胞儀：購自美國BD公司；CFX ConnectTM實時熒光PCR儀；上海伯樂公司產(chǎn)品；Synergy 2型酶標儀：美國BioTek公司制造。

1.2.2試劑 熒光素標記單克隆抗體：抗-CD4-FITC、抗-IFN-γ-PE、抗-IL-22-PeCy5、抗-IL-17-APC均購自eBioScience公司，分別與抗-IFN-γ、抗-IL-22、抗-IL-17相匹配的同型抗體IgG1-PE、IgG1-PeCy5和IgG1-APC，均購自eBioScience公司，以上各抗體均為小鼠抗人單抗；激活劑：佛波醇酯(PMA)和協(xié)同刺激劑：鈣離子霉素(Ionomycin)、透膜劑均為Sigma公司產(chǎn)品；蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑：莫能霉素(Monensin)為eBioScience公司產(chǎn)品；Trizon試劑、RNA提取試劑盒、HiFiScriptcDNA第一鏈合成試劑盒、PCR擴增試劑盒、Ultra SYBR Mixture均為康為世紀公司產(chǎn)品；AhR RNA引物為上海生工生物工程有限公司合成；IL-22 ELISA試劑盒購自美國Cloud Clone公司。

1.3流式細胞術(shù)檢測外周血Th22細胞的頻率

1.3.1細胞刺激與培養(yǎng) 取各組肝素抗凝全血1 mL，與RPMII 1640培養(yǎng)液1∶1混合后，置培養(yǎng)板培養(yǎng)，加入PMA稀釋液5 μL/mL(終濃度100 ng/mL)，Ionomycin 2 μL/mL(終濃度1 μg/mL)，37 ℃，5% CO2靜置培養(yǎng)2 h后,再加Monensin 1 μL/mL(終濃度2.5 μmol/L)阻斷細胞因子分泌，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，各實驗組均同時設置單加Monensin對照組。

1.3.2細胞表面抗原及胞漿內(nèi)細胞因子染色 收集培養(yǎng)后的細胞，4℃離心后吸取壓積紅細胞層100 μL到各流式管中，加入抗-CD4-FITC做細胞表面染色，4 ℃避光反應20 min，經(jīng)溶血后離心棄上清液，以2%多聚甲醛(PFA)固定30 min，經(jīng)破膜后最后加入抗-IL-22-PeCy5、抗-IL-17-APC和抗-IFN-γ-PE于檢測管內(nèi)進行胞內(nèi)染色，同型對照管加入相應匹配的抗人m IgG1-PeCy5、m IgG1-APC和m IgG1-PE，避光冰浴30 min，洗滌、固定、重懸細胞，上流式細胞儀檢測，每管收集8萬～10萬個細胞數(shù)據(jù)，以同型對照管設定陰性區(qū)域，各測定管陽性率減去同型管即為特異度陽性率，CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+細胞為Th22細胞。

1.4RT-PCR法檢測外周血中轉(zhuǎn)錄因子AhR mRNA 相對表達量

1.4.1標本收集與保存 取各組EDTA-Na2抗凝全血1mL，每管吸取300 μL到RNase-FreeEppendorf管，再加入1 mL Trizon試劑，用移液槍反復吹打或渦旋混合器混合均勻，保存在-80 ℃冰箱備用，防止RNA降解。

1.4.2細胞總RNA的提取 從-80 ℃冰箱中取出樣品，待其解凍后，把上清轉(zhuǎn)移到一個新的RNase-Free 離心管中,加入200 μL氯仿，劇烈震蕩后靜置，離心待其分層，RNA主要在水相層中，把水相層(約500 μL)轉(zhuǎn)移到一個新的預冷的1.5 mL RNase-Free 離心管中，加入等體積預冷的70%乙醇，顛倒混勻，經(jīng)柱提法離心、洗滌和洗脫后得到RNA，以分光光度計檢測260/280比值，均在1.8～2.0之間。

1.4.3逆轉(zhuǎn)錄反應 cDNA第一鏈合成RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA：RNA 7 μL，脫氧核糖核甘三磷酸(dNTP，10 mmol/L)4 μL，引物Primer Mix 2 μL，5× RT Buffer 4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶HiFi Script 1 μL，DTT 2 μL，總體系20 μL，反應條件：加入RNA、dNTP、Primer Mix后70 ℃孵育10 min，再放到冰箱中冰浴2 min，再加入5×RT Buffer、HiFi Script、DTT后，50 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min。

1.4.4熒光定量PCR(qRT-PCR) 根據(jù)GenBank中目的基因序列按照引物設計原則使用軟件Primer Premier 5.0自行設計，經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST驗證其特異性，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，所用內(nèi)參為3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，引物序列及反應條件見下表1。在PCR反應管依次加入上述cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Ultra SYBR Mixture 12.5 μL，RNase Free dH2O 9.5 μL，總體系25 μL，按以下條件進行擴增：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。擴增結(jié)束后采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 QRT-PCR檢測引物序列及擴增范圍

1.5ELISA法檢測 外周血清IL-22的水平不加抗凝劑抽取各組全血2 mL吸取血清100 μL，按ELISA試劑盒操作說明書進行檢測，最低檢測限2.8 pg/mL。

2 結(jié) 果

2.1Th22細胞占CD4+T細胞的比例 活動期SLE患者組和非活動期SLE患者組外周血Th22細胞的比例均顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時活動期SLE患者Th22細胞比例顯著低于非活動期SLE患者組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如表2所示，典型流式圖見圖1所示，R1為淋巴細胞群，以CD4-FITC和IFN-γ-PE分出CD4+IFN-γ-細胞群R2，在IL-22-PeCy5和IL-17-APC點陣圖設定G2=R1*R2，分析R2細胞群內(nèi)IL-22+IL-17-細胞即為Th22細胞(CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+細胞)。

2.2轉(zhuǎn)錄因子AhR mRNA的相對表達量 活動期SLE患者組與非活動期SLE患者組AhR mRNA的相對表達量，二者相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但無論活動期還是非活動期SLE患者組，均顯著低于健康對照組(AhR mRNA的相對表達量為1)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 SLE患者組與健康對照組外周血Th22細胞占

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與非活動期SLE患者比較，▲P<0.05

圖1 SLE患者組及健康對照組典型流式圖

2.3外周血清IL-22的水平活動期 SLE患者組和非活動期SLE患者組外周血清IL-22的水平分別為167.19、168.78 pg/mL，均顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但活動期SLE患者IL-22的水平與非活動期SLE患者組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 活動期SLE組、非活動期SLE組和健康對照組

注：與健康對照組比較，*P<0.05

表4 SLE患者組與健康對照組外周血清

注：與健康對照組比較，*P<0.05

2.4相關(guān)性分析 SLE活動期患者外周血中IL-22的水平和AhR mRNA的表達水平均與Th22的細胞比例呈正相關(guān)(r=0.849、0.778,P=0.000、0.001)，同時AhR mRNA的表達水平與IL-22的水平呈正相關(guān)(r=0.654，P=0.01)，SLE活動期患者Th22細胞比例與SLEDAI指數(shù)呈負相關(guān)(r=-0.758，P=0.007，但IL-22的水平和AhR mRNA的表達水平均與SLEDAI指數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

通常觀點認為，SLE為“B細胞類疾病”即患者體內(nèi)介導體液免疫的B細胞過度活化導致免疫球蛋白譜改變，自身抗體的大量產(chǎn)生以及補體活化造成的機體損傷[2]，而單純B細胞的過渡活化必然伴有輔助性Th的協(xié)助方可引起SLE的炎性反應，因此，T細胞的異?；罨蚑h細胞異常分泌細胞因子則被認為是SLE發(fā)病的關(guān)鍵因素。Th22細胞則是新近發(fā)現(xiàn)的一種獨立Th細胞亞群[1]，其關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是AhR，主要分泌IL-22、IL-26、IL-13等細胞因子[3]，同時IL-6、TNF-α共同對Th22細胞的分化起誘導作用。Th22細胞在自身免疫病和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，主要通過激活后分泌大量的IL-22來實現(xiàn)[4-5]。在正常情況下，Th22細胞與Th17細胞、Treg細胞及其他細胞亞群互相調(diào)控，使機體處于免疫平衡狀態(tài)，在慢性炎性疾病中，Th22細胞功能喪失，將使慢性炎性疾病惡化。

作為Th22細胞調(diào)節(jié)分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，AhR在生物中的表達非常廣泛，并且具有高度保守性，其參與調(diào)控編碼細胞色素P450蛋白，在機體的多種生理機能及疾病的進展中發(fā)揮一定的作用，許多自身免疫性疾病的發(fā)生可能與AhR配體及毒物代謝酶的活性有關(guān)[6],并且其可以調(diào)控Th17細胞和Treg細胞的分化[7]，這使得AhR在免疫學領(lǐng)域中引起了越來越多的關(guān)注。

在本研究中，筆者不僅聚焦在SLE患者中Th22細胞的表達，還同時探討其上游調(diào)控分化的轉(zhuǎn)錄因子AhR對SLE的影響及與Th22的關(guān)系，并觀察了其下游的表達產(chǎn)物IL-22在SLE血清中的表達及與Th22的關(guān)系，以期能較為全面分析Th22細胞在SLE炎性反應中的作用機制。筆者發(fā)現(xiàn)活動期SLE患者組和非活動期SLE患者組Th22細胞比例均顯著低于健康對照組，同時活動期SLE患者組的Th22細胞比例顯著低于非活動期患者組，這說明Th22細胞的表達頻率與SLE疾病的進展和活動度有一定的關(guān)系，進一步的相關(guān)分析表明，Th22細胞的比例與SLE的疾病活動度指數(shù)SLEDAI之間存在負相關(guān)關(guān)系。該結(jié)果與YANG等[3]報道的結(jié)果略有不同，后者對SLE并發(fā)的器官損害進行了分類，尤其以合并腎炎患者Th22細胞表達顯著降低，但對合并皮膚損害的患者Th22的比例增高。

對Th22細胞下游功能分子IL-22的檢測發(fā)現(xiàn)，SLE患者血清IL-22的水平顯著低于健康對照組，但活動期組與非活動期組之間差異無統(tǒng)計學意義，IL-22的水平與SLEDAI無相關(guān)性，該結(jié)果與岳林環(huán)等[8]報道的結(jié)果基本一致。IL-22是Th22細胞最重要的效應因子，IL-22有多種細胞來源，Th22、Th1、Th17細胞及其他淋巴細胞都能分泌表達IL-22，相關(guān)分析表明，IL-22與Th22細胞呈正相關(guān)，這提示在SLE患者中，IL-22主要來源于Th22細胞，因此研究IL-22在SLE 中的作用對揭示Th22細胞在SLE的發(fā)病和進程的作用至關(guān)重要。另一方面，多種細胞因子的網(wǎng)絡調(diào)控效應對不同SLE病程階段的影響也會不同，可能尚存有其他調(diào)控機制導致活動期SLE與非活動期SLE的IL-22的水平差異無統(tǒng)計學意義。

本研究采用qRT-PCR技術(shù)證實了外周血淋巴細胞中AhRmRNA的表達水平在SLE中顯著降低，相關(guān)分析表明，作為Th22細胞上游調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達水平與Th22細胞頻率呈顯著正相關(guān)，這也提示AhR可能通過干擾淋巴細胞活化和功能進而促進SLE疾病發(fā)病。有研究顯示，多種炎性細胞因子包括IL-22及其受體、受體相關(guān)蛋白基因的啟動子或增強子區(qū)域，具有AhR結(jié)合序列的DRE位點，進而AhR能直接或間接調(diào)控炎性細胞因子的產(chǎn)生和分泌[9-10]。本研究的結(jié)果也證實了這一點，AhR在SLE顯著降低，影響到下游IL-22的產(chǎn)生和分泌，其水平也顯著低于健康對照，進一步的相關(guān)分析表明，二者存在正相關(guān)，由此可以推見，AhR可能是SLE調(diào)控免疫反應，控制炎癥效應的關(guān)鍵分子。而在活動期SLE組和非活動期SLE組患者，AhR的表達水平差異無統(tǒng)計學意義，并且AhR的表達與SLEDAI指數(shù)無顯著相關(guān)性，這可能源于有部分患者在臨床診療過程中或疾病早期未確診之前自行服用激素或免疫

抑制劑而干擾SLE典型癥狀的出現(xiàn)，這對疾病活動度的判斷可能產(chǎn)生較大影響。當然，這還需要大樣本的研究以了解這些指標的相關(guān)性。

4 結(jié) 論

SLE患者Th22細胞表達降低，可能源于AhR直接或間接調(diào)控炎性細胞因子的產(chǎn)生和分泌，從而導致不同免疫細胞亞群的免疫失衡，這也提示改變或促進Th22細胞分化的上游或下游通路可能減輕SLE的免疫炎性反應，Th22細胞水平可以作為SLE診療的潛在靶點和輔助標志物。