益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法通過JAK/STAT通路對急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

急性心肌缺血表現(xiàn)為冠狀動脈的急性閉塞所致的心肌細(xì)胞缺血、缺氧、凋亡的一系列過程，為臨床常見病，威脅著人類健康。有研究表明，急性心肌梗死后的心肌細(xì)胞中存在細(xì)胞凋亡[1]。JAK-STAT信號通路在心肌缺血再灌注過程中對心臟有重要的保護(hù)作用[2]，當(dāng)其受到抑制，可激活Caspase-3前體，啟動細(xì)胞凋亡[3]。本研究采用具有益氣養(yǎng)陰通絡(luò)功效的雙參通脈顆粒干預(yù)大鼠急性心肌缺血模型，觀察其對JAK/STAT通路的影響，探討中藥干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 雙參通脈顆粒，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，由人參、黃芪、麥冬、當(dāng)歸、丹參、川芎等組成，采用傳統(tǒng)顆粒制備方法，批號 20160531。鹽酸地爾硫卓片，天津田邊制藥有限公司生產(chǎn)，每片30 mg，國藥準(zhǔn)字： H12020126。麻醉藥水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號分別為 20130413，20131127)，現(xiàn)用現(xiàn)配； EliVision plus試劑盒(中國福州邁新生物科技有限公司kit-9902)，DAB Kit(中國福州邁新生物科技有限公司DAB-1031)，蘇木素染色液(中國南京建成公司 D005)，Invent 總蛋白提取試劑盒(美國 Invent SD001/SN002)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 MP150 多導(dǎo)生理信號采集系統(tǒng)(德國Leica公司)、高速臺式離心機(jī)(德國Eppdendorf公司)、BB23型培養(yǎng)箱(美國PE公司)、ROTEAN 電泳系統(tǒng)(美國Bio公司)、冰凍切片機(jī)OM3123 型(瑞典Bio公司)、恒溫恒濕箱(上?？萍忌锕?、多功能酶標(biāo)儀(美國Cell Signaling公司)等。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 選取健康SD大鼠，共60只，隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組10只。對模型組、中藥各劑量組、西藥組實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行造模，復(fù)制急性心肌缺血模型。取大鼠稱重，采用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g，腹腔麻醉后固定于手術(shù)臺上，氣管切開，呼吸機(jī)輔助呼吸(頻率 85 次/min，潮氣量 18 mL，吸呼比1∶1)，連接心電檢測儀，術(shù)中記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于左冠狀動脈前降支起始下2 mm處結(jié)扎，假手術(shù)組不結(jié)扎，檢查無出血，逐層關(guān)閉胸腔。

1.2.2 給藥方法 按人和動物等效劑量換算法折算大鼠劑量進(jìn)行換算，假手術(shù)組及模型組予生理鹽水灌胃每次3 mL，每日2 次。西藥組予以鹽酸地爾硫卓片灌胃，劑量為4.23 mg/kg。中藥低劑量組給予相當(dāng)生藥量9.37g/(kg·d)；中藥中劑量組給予相當(dāng)生藥量18.75 g/(kg·d)；中藥高劑量組給予相當(dāng)生藥量37.5 g/(kg·d)，均制成 6 mL，每次3 mL，每日2 次，療程2周。

1.2.3 血流動力學(xué)測定 取材前分離右側(cè)頸總動脈，左心導(dǎo)管插管至左心室，由 ALC-MPA 多導(dǎo)生物信號分析系統(tǒng)記錄血流動力學(xué)參數(shù)。

1.2.4 免疫組化法檢測P-STAT3蛋白表達(dá) 取心肌組織連續(xù)2塊厚2～3 mm，將標(biāo)本固定于4%多聚甲醛中，觀察各級乙醇脫水，石蠟固定進(jìn)行常規(guī)切片，按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟，水合，再于二甲苯、各級乙醇中脫水，抗原修復(fù)，抗原-抗體反應(yīng)，蘇木精-伊紅(HE)復(fù)染，二甲苯透明、濾紙吸干、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 蛋白提取及指標(biāo)檢測 取缺血心肌組織數(shù)塊，提取蛋白，進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳。采用Western blot方法測定心肌細(xì)胞中的Caspase-3蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠左心室功能檢測 治療結(jié)束后中藥各劑量組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)均發(fā)生了改變，與模型組相比，各治療組左心室收縮功能(LVSF)明顯升高(P<0.05)，左心室舒張功能(LVDF)顯著降低(P<0.05)； 中藥高劑量組血流動力學(xué)改善最明顯。詳見表1。

表1 各組大鼠左心室功能比較(±s)mmHg

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05； 與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 各組大鼠P-STAT3蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組P-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低；與模型組比較，各治療組P-STAT3蛋白表達(dá)均升高，其中，中藥高劑量組蛋白表達(dá)升高明顯。詳見圖1、表2。

假手術(shù)組 模型組 西藥組

中藥低劑量組 中藥中劑量組 中藥高劑量組

圖1各組大鼠P-STAT3蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠P-STAT3蛋白表達(dá)光密度平均值(IOD/area)比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-3表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組Caspase-3表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) 。中藥高劑量組與西藥組、中藥中劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖 2。

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

圖2Westernblotting檢測各組Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

JAK/STAT通路參與了多種細(xì)胞因子和生長因子介導(dǎo)的信號傳遞，心肌缺血缺氧產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，激活 JAK-2，啟動 JAK/STAT 信號通路，使 STAT3 磷酸化，P-STAT3二聚化后轉(zhuǎn)入核內(nèi)，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄合成 Bcl-2等多種心肌保護(hù)因子，介導(dǎo)心肌保護(hù)作用[4-5]。當(dāng)通路被阻斷，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)增高，激活下游的凋亡效應(yīng)酶 Caspase-3，使細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 修復(fù)、組織平衡、細(xì)胞存活等環(huán)節(jié)中的重要蛋白水解，從而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡[6]。Caspase-3作為終端剪切酶，主要于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中表達(dá)，被稱為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。

現(xiàn)代藥理研究表明，中藥具有調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡，抗氧自由基損傷，減輕炎癥反應(yīng)，抑制鈣離子超載等作用[7]。本研究選用具有益氣養(yǎng)陰通絡(luò)功效的雙參通脈顆粒，由人參、黃芪、麥冬、當(dāng)歸、丹參、川芎六味藥物組成。方中人參、黃芪補(bǔ)益元?dú)?，?dāng)歸、丹參活血養(yǎng)血，川芎引血上行，麥冬益胃生津，全方散中有補(bǔ)，補(bǔ)而不膩。氣虛則無以行血，陰虛則脈絡(luò)不通，氣陰兩虛、心血瘀阻為胸痹心痛病機(jī)之一?，F(xiàn)有研究表明，人參皂苷Re預(yù)處理對急性心肌缺血大鼠心肌有較好的保護(hù)作用，該作用可能與激活JAK2/STAT3 通路有關(guān)[8]。丹參酮ⅡA 可降低缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，其保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號通路有關(guān)[9]。丹參可抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)控BAX、Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)[10]。

益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法能夠抑制急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)P-STAT3蛋白表達(dá)、下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。