生物絮團(tuán)養(yǎng)蝦場(chǎng)幼苗階段零換水添加益生菌的效果分析

譯/黃經(jīng)獻(xiàn)

凡納濱對(duì)蝦是沿海非常重要的養(yǎng)殖物種，近年來由于病害、水質(zhì)等問題導(dǎo)致養(yǎng)蝦場(chǎng)損失慘重。為了減少損失，養(yǎng)蝦場(chǎng)開始在生物絮團(tuán)系統(tǒng)中養(yǎng)蝦。這種系統(tǒng)通過限制水交換為養(yǎng)殖品種營(yíng)造良好的水環(huán)境。通過嚴(yán)格管理不換水，在養(yǎng)殖系統(tǒng)中積累有機(jī)物和營(yíng)養(yǎng)物促進(jìn)微生物菌落生長(zhǎng)，多樣化微生物穩(wěn)定了系統(tǒng)，比如轉(zhuǎn)化微生物產(chǎn)生的氮化合物，維持水質(zhì)、提供營(yíng)養(yǎng)，通過降低飼料消耗比，降低了飼料成本，提高了養(yǎng)殖生物健康狀況。近年來，高密度養(yǎng)蝦場(chǎng)開始應(yīng)用微生物群落，然而相關(guān)研究非常少。益生菌包括一些潛在的有益菌作為餌料添加劑被使用。水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，微生物群和養(yǎng)殖物長(zhǎng)期接觸，物種與環(huán)境之間有著直接的相互作用。Verschuere發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖添加益生菌的新功能，比如影響?zhàn)B殖水中微生物菌落和水質(zhì)量。有報(bào)道稱益生菌能促進(jìn)酶消化，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)室可控環(huán)境結(jié)果顯示非常有效。但養(yǎng)殖場(chǎng)中環(huán)境每天變化，動(dòng)態(tài)環(huán)境、自然界微生物等影響益生菌效果。在養(yǎng)蝦場(chǎng)很難頻繁地進(jìn)行可控的生物鑒定，結(jié)果不可靠。因此一些養(yǎng)蝦場(chǎng)應(yīng)用的益生菌與自然菌群的效果差異缺乏有效評(píng)估。我們探索方法來評(píng)估有益菌在提升有益細(xì)菌數(shù)量、水質(zhì)和蝦生產(chǎn)參數(shù)等方面的功效，評(píng)估兩種商品化益生菌對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)異養(yǎng)、弧菌、硝化作用的影響以及對(duì)零換水養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦期間沉淀物、含氮化合物和生產(chǎn)參數(shù)的影響，本研究結(jié)果將對(duì)生物絮團(tuán)養(yǎng)蝦場(chǎng)提供有益的信息。

一、材料及方法

（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)在墨西哥錫納羅亞高密度養(yǎng)蝦場(chǎng)進(jìn)行，該公司在生物絮團(tuán)系統(tǒng)中養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦，90天可達(dá)10g/尾～12g/尾，包括30天零換水、60天少量（每天3%～5%換水量）換水2個(gè)階段，整個(gè)養(yǎng)殖過程添加益生菌。為避免換水過程外界菌落影響，本實(shí)驗(yàn)選擇零換水養(yǎng)殖階段在70m3池塘中進(jìn)行，建立3個(gè)處理：添加益生菌的PB1、PB2和未添加的PBN，每個(gè)處理3個(gè)平行。PB1添加菌類（桿菌、乳酸、乳桿菌、酵母菌）和當(dāng)?shù)匚⑸锶?，各?0%；PB2中添加由一種微量元素混合物（穩(wěn)定劑和促進(jìn)生長(zhǎng)的酶，各占50%）孵化的益生菌；對(duì)照組PBN應(yīng)用當(dāng)?shù)刈匀坏奈⑸锶海▊鹘y(tǒng)的生物絮團(tuán)系統(tǒng)，未添加益生菌。

（二）益生菌的應(yīng)用

利用2個(gè)有效容積1000L的生物反應(yīng)器培育菌落，通過底部增氧保證充分通氣。鹽度為33～35的海水首先用5μm紗網(wǎng)過濾，然后用次氯酸鈉消毒，12小時(shí)后硫代硫酸鈉中和。生物反應(yīng)器按照1kg/m3用量注入糖漿（有效含量100g/m3）作為碳源，同時(shí)加入一種微量元素混合物。益生菌在（30±3）℃水溫下培育36小時(shí)。在這種條件下異養(yǎng)菌密度能達(dá)到80×106CFU/mL～120×106CFU/mL。PB1、PB2池塘在養(yǎng)蝦前6天注滿，PBN則提前1天注滿水。自加滿水起，PB1、PB2每3天注入70L益生菌，PBN不接種益生菌。

（三）養(yǎng)殖環(huán)境

實(shí)驗(yàn)選取同一個(gè)公司培育的12天凡納濱對(duì)蝦仔蝦，規(guī)格為7.3mg/尾，以500尾/m2的密度投入長(zhǎng)方形池塘中養(yǎng)殖，池塘體積約70m3（20m×3m×1.17m），塘底用高密度聚乙烯覆蓋。9個(gè)實(shí)驗(yàn)池塘置于塑料大棚中（圖1），自然光照，采用100Hp/Ha鼓風(fēng)機(jī)充氣，氣頭放入池底，保證氧氣充足和固體顆粒懸浮。投苗前6天添加過濾（5μm濾孔）海水，用含35%粗蛋白的飼料喂養(yǎng)，投喂量為蝦體重8%～20%，每2小時(shí)投1次料。每個(gè)池塘每天投入數(shù)量不等的糖漿，使每個(gè)池塘C:N比保持為12:1。

圖1 生物絮團(tuán)養(yǎng)蝦車間

（四）水質(zhì)監(jiān)控

每6小時(shí)測(cè)1次水溫、溶氧，每天測(cè)2次pH，每周測(cè)1次鹽度。每3天用沉降測(cè)定管測(cè)沉淀物，沉降標(biāo)準(zhǔn)為20分鐘。總氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽每周測(cè)1次。每個(gè)池塘取250mL海水，沉淀后取上層水進(jìn)行以上指標(biāo)測(cè)定。總氨氮采用水楊酸鹽（8155）法測(cè)定，亞硝酸鹽通過重氮化作用測(cè)定（8507），硝酸鹽采用鎘氧化還原法測(cè)定（8171）。

（五）生物絮團(tuán)細(xì)菌測(cè)定

每3天從每個(gè)池塘3個(gè)位置均勻取水樣，然后在養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)定。PB1、PB2養(yǎng)蝦前6天投入益生菌開始監(jiān)測(cè)。PBN從開始放入蝦苗起進(jìn)行監(jiān)測(cè)，采用平板涂布法測(cè)定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)池取3份水樣接種。第1至第30天監(jiān)測(cè)活異養(yǎng)菌，樣品（30±2）℃溫度下在海水瓊脂中培養(yǎng)（24±2）小時(shí)；同時(shí)監(jiān)測(cè)硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽汁糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的弧菌。第15天至30天，監(jiān)測(cè)在海水氧化劑中培育的氧化細(xì)菌，培養(yǎng)期在（30±2）℃溫度下持續(xù)7天～10天。

（六）蝦生產(chǎn)參數(shù)

在生物鑒定結(jié)束時(shí)每個(gè)池塘取樣測(cè)算對(duì)蝦生長(zhǎng)速度、成活率和餌料系數(shù)。特定生長(zhǎng)速率參照Biswas法測(cè)定。

特定生長(zhǎng)速率=[結(jié)束時(shí)生長(zhǎng)體重（g）-起始體重（g）]/生長(zhǎng)周期（天）

（七）數(shù)據(jù)分析

假設(shè)當(dāng)量（卡方檢驗(yàn)）和平均方差被判定，水質(zhì)參數(shù)、細(xì)菌密度、存活率、最終體重、特定生長(zhǎng)速率、FCR利用單因素方差分析。另外，如果統(tǒng)計(jì)分析存在顯著差異，則采用多重比較的圖基檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)采用Statistica8.5.1軟件處理。

二、結(jié)果

（一）水質(zhì)變化

實(shí)驗(yàn)池水質(zhì)變化相似，所有實(shí)驗(yàn)池?zé)o顯著差異。溶氧變化范圍5.22mg/L～5.59mg/L，水溫32.4℃～32.7℃，鹽度35.3～36.8，固體顆粒2.53mg/L～3.12mg/L，pH6.8～8.3（表1）?？偘钡罡吆砍霈F(xiàn)在第15天，PBN、PB2池塘分別達(dá)到2.48mg/L和2.51mg/L，養(yǎng)殖末期降至1.49mg/L～1.61mg/L，實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異（表1）。所有實(shí)驗(yàn)組亞硝酸鹽隨著養(yǎng)殖時(shí)間而增加，平均為4.45mg/L～5.63mg/L，不同實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異（表1）。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)組硝態(tài)氮均為1.0mg/L，隨后上升，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，平均達(dá)17.77mg/L～18.77mg/L，不同實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異（表1）。

（二）細(xì)菌種類

為測(cè)定數(shù)量趨勢(shì)，細(xì)菌濃度轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)og。所有實(shí)驗(yàn)組活異養(yǎng)菌隨著養(yǎng)殖時(shí)間而增加（圖2a）。第1天在PBN濃度比PB1、PB2低。但從第6天開始直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束濃度相似（圖2a）?；【郝浔环譃辄S色和綠色，黃色隨著養(yǎng)殖時(shí)間而增加（圖2b），但綠色變化的趨勢(shì)不明顯（圖2c）。

把實(shí)驗(yàn)期分成3個(gè)階段：第1天（開始期）、第15天（中間期）、第30天（結(jié)束期），采用單因素方差分析實(shí)驗(yàn)組間差異?；町愷B(yǎng)菌（VHB）第1天在PBN濃度為0.1×106CFU/mL，PB1濃度為0.7×106CFU/mL，PB2濃度為0.4×106CFU/mL，存在顯著差異。隨后的不同實(shí)驗(yàn)階段活異養(yǎng)菌濃度差異不顯著，其中第15天時(shí)濃度為3.3×106CFU/mL～4.2×106CFU/mL，第30天時(shí)濃度為38.2×106CFU/mL～65.3×106CFU/mL（表2）。氨氧化細(xì)菌（AOB）兩個(gè)實(shí)驗(yàn)階段濃度差異不顯著，第15天濃度為1.1×106CFU/mL～1.6×106CFU/mL，第30天濃度為53.7×106CFU/mL～79.8×106CFU/mL（表2）。黃色弧菌（YVLB）不同實(shí)驗(yàn)階段濃度差異顯著，第1天濃度為0.9×103CFU/mL～2.4×103CFU/mL，第30天濃度為35.5×103CFU/mL～107.1×103CFU/mL（表2）。綠色弧菌（GVLB）不同實(shí)驗(yàn)階段濃度存在顯著差異，第1天為0.023×103CFU/mL～0.22×103CFU/mL，第30天為1.67×103CFU/mL～4.23×103CFU/mL（表2）。

表1 PBN、PB1、PB2養(yǎng)殖過程中水質(zhì)參數(shù)（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

圖2 活異養(yǎng)菌、黃色弧菌、綠色弧菌數(shù)量與時(shí)間關(guān)系

（三）蝦生產(chǎn)參數(shù)

最初蝦苗規(guī)格為7.3mg/尾，養(yǎng)殖結(jié)束時(shí)平均體重為1.44g/尾～1.54g/尾。個(gè)體生長(zhǎng)速度為1.43g/尾～1.53g/尾，特定生長(zhǎng)速率為14.03%/天～14.17%/天，存活率為85.0%～92.37%，飼料轉(zhuǎn)化率為0.83～0.98，不同實(shí)驗(yàn)組蝦生產(chǎn)參數(shù)差異不顯著（表3）。

三、討論

表2 活異養(yǎng)菌、氨氧化菌、黃色弧菌、綠色弧菌各階段濃度變化

表3 凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖30天后生產(chǎn)參數(shù)（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

實(shí)驗(yàn)期間水質(zhì)參數(shù)（pH、溶氧、鹽度、水溫）符合凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖用水標(biāo)準(zhǔn)，平均值和以往報(bào)道相似。當(dāng)零換水或少換水時(shí)，養(yǎng)殖系統(tǒng)中有機(jī)物積累促使異養(yǎng)微生物濃度增加，異養(yǎng)微生物利用有機(jī)物作為能量來源進(jìn)行繁殖。本研究結(jié)果如預(yù)期，異養(yǎng)微生物整個(gè)養(yǎng)殖期一直在增加。

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，與PBN相比，PB1、PB2微生物濃度最高，但自第6天起，實(shí)驗(yàn)組PB1、PB2之間不存在顯著差異。對(duì)照組PBN異養(yǎng)菌的出現(xiàn)是水中自然存在的原因，通過添加糖漿及有機(jī)物積累促使?jié)舛仍黾?。?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)微生物濃度為38.2×106CFU/mL～65.3×106CFU/mL，Yuniasari和Ekasari評(píng)估了凡納濱對(duì)蝦孵化期添加益生菌的效果，研究發(fā)現(xiàn)整個(gè)養(yǎng)殖期細(xì)菌數(shù)量自第1天的1×104CFU/mL增至第25天的100×106CFU/mL，另外細(xì)菌濃度添加組和對(duì)照組是相似的。本研究結(jié)果顯示活異養(yǎng)菌濃度變化趨勢(shì)與Burford等研究結(jié)果是相似的，變化范圍為36.4×106cell/mL～50.6×106cell/mL。

整個(gè)硝化過程中包括細(xì)菌氨氧化和亞硝酸鹽氧化。本研究中采用的養(yǎng)殖培養(yǎng)基可以保證氨氧化數(shù)量統(tǒng)計(jì)的精度，微生物在養(yǎng)殖系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)地位，它們可以把總氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。養(yǎng)殖結(jié)束時(shí)，氨氧化細(xì)菌濃度達(dá)53.7×106CFU/mL～79.8×106CFU/mL，結(jié)果與預(yù)期相似，因?yàn)橄趸?xì)菌依靠含氮化合物增殖，這些氮化合物是由異養(yǎng)菌產(chǎn)生。對(duì)一個(gè)中等密度養(yǎng)蝦場(chǎng)硝化細(xì)菌產(chǎn)生研究發(fā)現(xiàn)，密度達(dá)到10×106cell/mL～100×106cell/mL的細(xì)菌種類包括假單胞菌、硝化桿菌、亞硝化螺菌，研究過程采用了分子探針技術(shù)，雖然由于某些原因數(shù)據(jù)沒有可比性，但指出了養(yǎng)殖水中存在高密度的懸浮顆粒和含氮化合物。本研究發(fā)現(xiàn)存在硝態(tài)氮，盡管沒有監(jiān)測(cè)到，但應(yīng)當(dāng)存在亞硝酸鹽氧化細(xì)菌。這個(gè)結(jié)論是基于以前學(xué)者研究的整個(gè)消化作用進(jìn)程。

弧菌廣泛存在自然海水中，也出現(xiàn)在養(yǎng)蝦過程中。這種菌可以引起水生動(dòng)物各種疾病影響?zhàn)B殖生產(chǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖過程中，黃色弧菌濃度逐漸增加，弧菌的高濃度和水體中有機(jī)物高負(fù)荷有關(guān)，這種現(xiàn)象在生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中普遍存在。PBN組養(yǎng)殖末期，黃色、綠色弧菌濃度都比較高，分別達(dá)107.1×103CFU/mL、4.23×103CFU/mL，但和添加益生菌組相比蝦存活率無顯著差異?？傮w來說，弧菌的數(shù)量和Luis-Villase?or報(bào)道類似，該學(xué)者發(fā)現(xiàn)在凡納濱對(duì)蝦幼蝦生物絮團(tuán)養(yǎng)殖過程中弧菌密度為1.57×104CFU/mL，高于Brito等報(bào)道的0.4×103CFU/mL～2.20×103CFU/mL。需要指出的是，本實(shí)驗(yàn)是在養(yǎng)蝦場(chǎng)70m3池塘中進(jìn)行的，不像其它實(shí)驗(yàn)在可控的小水體中完成。當(dāng)細(xì)菌群落平衡被打破，弧菌成為條件致病菌。而病原菌與生物絮團(tuán)系統(tǒng)微生物相互作用或降低疾病發(fā)生的概率。本實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖30天時(shí)，在PB1、PB2和PBN組中，弧菌與異養(yǎng)菌比例分別為0.19%、0.06%、0.22%，與上述抑制效果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)添加益生菌沒有提高蝦生產(chǎn)參數(shù)，養(yǎng)殖密度為160尾/m2時(shí)，特定生長(zhǎng)速率與實(shí)驗(yàn)室獲得的數(shù)據(jù)（15.7%/天～20.3%/天）相比要低，但存活率（86%～93%）相似。養(yǎng)殖密度為1200尾/m2時(shí)，本研究獲得的特定生長(zhǎng)速率數(shù)據(jù)比育苗階段（11.1%/天～11.4%/天）要高，但存活率（97.4%～99.5%）相似，結(jié)果顯示特定生長(zhǎng)速率與養(yǎng)殖密度有關(guān)，與存活率無關(guān)。一些報(bào)道宣稱益生菌的使用可以促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖，也有報(bào)道說沒有明顯效果，甚至濫用益生菌對(duì)養(yǎng)殖生物、生態(tài)系統(tǒng)有負(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)中PBN組含有益的微生物，零換水促進(jìn)益生菌增殖。實(shí)際上大多數(shù)生物絮團(tuán)實(shí)驗(yàn)方案不添加益生菌，但需要做大量工作分析自然微生物的種類及在系統(tǒng)中的作用，Martínez-Porchas和Vargas-Albores稱養(yǎng)殖系統(tǒng)中細(xì)菌種類及在微觀世界功能仍然不確定，因?yàn)榇蠖鄶?shù)環(huán)境中繁衍的細(xì)菌99%以上的種類是不易被培養(yǎng)的，所以微生物種類無法利用傳統(tǒng)技術(shù)鑒別，這是本實(shí)驗(yàn)的局限，但結(jié)論對(duì)粗略評(píng)估商業(yè)養(yǎng)殖條件下的細(xì)菌群落提供了支撐。

四、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)條件下與對(duì)照組PBN相比，實(shí)驗(yàn)組PB1和PB2通過添加不同成分益生菌，沒有對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)量、蝦生產(chǎn)參數(shù)產(chǎn)生顯著影響?？傊?，PBN條件下可以培養(yǎng)出異養(yǎng)細(xì)菌、硝化細(xì)菌和弧菌型細(xì)菌，這些細(xì)菌的密度與添加益生菌實(shí)驗(yàn)組類似。