JAZF1對膠質(zhì)母細胞瘤侵襲和遷徙的影響及分子機制研究

歐海榮 梁仔 龍霄翱 覃木秀 楊燕飛

膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中等級和惡性程度最高的一種腦腫瘤，常常表現(xiàn)為在大腦皮質(zhì)下浸潤性生長，同時向腫瘤周邊腦組織的侵襲和遷徙的能力較強，因此完全性切除困難，逃逸的腫瘤細胞極易引起術(shù)后的復(fù)發(fā)[1]。目前國內(nèi)外研究表明GBM 患者的平均生存期小于2年，并且約40%的患者術(shù)后輔助放射治療、化學(xué)治療后生存期仍不能達到1年[2]。眾所周知，GBM 術(shù)后的化學(xué)治療對患者非常關(guān)鍵，目前臨床上也強調(diào)術(shù)后盡早進行輔助放射治療、化學(xué)治療。然而，由于導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的突變基因數(shù)量眾多、類型復(fù)雜，臨床中常用的替莫唑胺的化學(xué)治療藥并不能覆蓋所有突變基因，因此治療效果尚不能取得滿意效果[3,4]。腫瘤個體化基因治療是未來發(fā)展的方向，因此亟需不斷完善腫瘤基因譜，為發(fā)現(xiàn)更多的藥物靶點提供理論依據(jù)。本研究中的JAZF1 基因，已有報道指出其在前列腺腫瘤、子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤等腫瘤中異常高表達，且與腫瘤的惡性程度相關(guān)[5-7]。但是關(guān)于JAZF1 基因在膠質(zhì)瘤中的作用研究報道少見，筆者對JAZF1 基因在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達及其表達對GBM 的侵襲和遷移的作用做了初步研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

材料與方法

一、細胞與試劑

人大腦GBM 細胞株U87M（美國ATCC 上海分公司）；JAZF1 干擾質(zhì)粒（JAZF1 shRNA，sc-75335-SH）和空載對照質(zhì)粒（Santa Cruze 公司，美國）；Matrigel（BD 公司，美國）；DMEM/F12 細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Lipofectamine 3000 （Invitrogen 公司，美國）；胎牛血清（fatal bovine serun，F(xiàn)BS）（Gibco 公司，美國）；RIPA 細胞組織裂解液和蛋白酶抑制劑（Takara 公 司，日 本）；JAZF1、p-AKT、AKT、MMP2、MMP9、GAPDH 抗體（Abcam 公司，美國）；山羊抗兔IgG 辣根過氧化物酶標(biāo)記（北京中杉金橋生物科技公司）；超敏ECL 和BCA 試劑盒（Thermo 公司，美國）；75%、95%的乙醇及甲醇生化實驗材料等（上海生物工程公司）。

二、實驗方法

（一）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

JAZF1 干擾質(zhì)粒 （JAZF1 shRNA，sc-75335-SH）和空載對照質(zhì)粒以Lipofectamine 3000 作為轉(zhuǎn)染試劑，操作方法按照廠家說明書進行。細胞的轉(zhuǎn)染在細胞融合度約為60%時進行，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，隔夜熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，約80%細胞轉(zhuǎn)染成功后可繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

（二）JAZF1 在美國癌癥基因數(shù)據(jù)庫中的資源

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（http://gliovis.bioinfo.cnio.es）中選擇TCGA_GBMLGG 數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫資料為全球可免費共享數(shù)據(jù)，不存在版權(quán)等利益沖突。在數(shù)據(jù)庫中選擇GliVis Explore，輸入JAZF1 基因，并選擇根據(jù)世界衛(wèi)生組織膠質(zhì)瘤等級分組（Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級），計算出數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)瘤患者中JAZF1 在不同級別膠質(zhì)瘤中的mRNA 水平差異及不同表達水平時患者的中位生存期差異。

（三）U87M 細胞的體外Trans-well 侵襲實驗

實驗組細胞轉(zhuǎn)染JAZF1 干擾質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。將用無血清培養(yǎng)基按1∶10 稀釋后的Matrigel 涂于Trans-well 小室內(nèi)的細胞生長面，將轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染干擾JAZF1 表達質(zhì)粒的U87M細胞加入到小室內(nèi)（5×105個/cm2），再用含10%FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)基500 μL 加入Trans-well 下室。培養(yǎng)至12 和24 h 后，擦去Matrigel 和上室內(nèi)細胞，多聚甲醛溶液（4%PFA）固定侵襲后細胞10 min，再以0.1%的結(jié)晶紫室溫染色10 min，純水輕柔漂洗3次后，將Trans-well 小室翻過來以底面朝上置于顯微鏡下拍照觀察。

（四）U87M 細胞的體外細胞劃痕實驗

將U87M 細胞接種于6 孔板內(nèi)，細胞生長至適宜密度后，以200 μL 槍頭垂直6 孔板底部劃痕，同時在實驗組轉(zhuǎn)染JAZF1 干擾質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。操作結(jié)束時間點為0 時，于0、12 和24 h 進行拍照觀察。

（五）Western blot 方法檢測蛋白表達量

細胞培養(yǎng)至預(yù)定實驗時間點后，取出細胞培養(yǎng)皿放置于冰上，后續(xù)操作均在冰上進行。移液器小心吸出培養(yǎng)液，然后用4℃的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 溶液輕柔潤洗細胞3遍后，棄去PBS，再加100 μL 細胞裂解液，在冰上裂解細胞30 min 后，提取細胞總蛋白，用Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度。取100 μg 蛋白與Loading Buffer混合后，100℃高溫煮沸10 min 以變性蛋白，然后用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（TBST 溶解）室溫?fù)u床封閉1 h，然后分別與JAZF1、p-AKT、AKT、MMP2、MMP9、GAPDH抗體（GAPDH稀釋比例為1∶5000，其余均為1∶1000，以5%BSA 稀釋）等一抗在4℃冰箱內(nèi)搖床過夜。次日，搖床上以TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入相應(yīng)種屬的二抗（5%BSA 稀釋，比例為1∶10 000）室溫環(huán)境中孵育1 h，TBST 漂洗3 次，每次5 min，用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色后使用化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)照相。蛋白相對表達強度=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0 軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用兩獨立樣本的t 檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 生存分析法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、JAZF1 在高級別膠質(zhì)瘤中的表達分析

為了研究JAZF1 在膠質(zhì)瘤中的作用，對TCGA數(shù)據(jù)庫中的620 例膠質(zhì)瘤患者的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在JAZF1 的mRNA 表達水平上，相較于Ⅱ級和Ⅲ級膠質(zhì)瘤，Ⅳ級膠質(zhì)瘤細胞中呈現(xiàn)高表達的趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1A）。同時，數(shù)據(jù)庫中根據(jù)JAZF1 表達水平分為高低組的337 例患者（高表達169 例，低表達168 例）的生存曲線分析結(jié)果可見，JAZF1 高表達組患者的中位生存期為13.0 個月，而低表達組中位生存期為30.2 個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。同時，對收集的臨床腫瘤標(biāo)本進行蛋白表達水平驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JAZF1 在蛋白的表達水平上與mRNA 水平一直在Ⅳ級膠質(zhì)瘤中呈高表達，而在Ⅱ～Ⅲ級膠質(zhì)瘤中呈低表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1C～D）。

圖1 JAZF1 在膠質(zhì)瘤中的表達及與患者生存期關(guān)系

二、JAZF1表達沉默后對GBM細胞株U87M侵襲和遷徙的影響

GBM 細胞株U87M 中轉(zhuǎn)染特定短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA） 干 擾U87M細胞中JAZF1表達，JAZF1 蛋白表達量顯著下降 （圖2A）。JAZF1 表達下降后，Trans-well 實驗和細胞劃痕實驗顯示，U87M 細胞的侵襲和遷徙能力均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2B～F）。

三、JAZF1沉默后p-AKT、MMP9、MMP2的表達下降

Western blot 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過干擾質(zhì)粒沉默U87M 細胞中JAZF1 的表達，JAZF1 的表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），此時促進腫瘤細胞侵襲和遷徙能力的相關(guān)關(guān)鍵蛋白MMP9、MMP2的表達水平也隨之顯著下調(diào)，同時調(diào)控MMP9、MMP2 的上游蛋白p-Akt 的表達下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Akt 的表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

討論

神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中膠質(zhì)瘤的治療目前是神經(jīng)外科疾病中非常棘手的問題，尤其是高級別的GBM，腫瘤發(fā)展迅速，腫瘤細胞極易向腫瘤周圍腦組織侵襲和遷移，以至于外科手術(shù)難以將腫瘤完全切除，患者術(shù)后容易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)，再次手術(shù)效果較差[8,9]。目前，高級別膠質(zhì)瘤的治療強調(diào)個體綜合性治療，術(shù)后盡早進行放射治療、 化學(xué)治療能夠延長患者的生存期，然而，國內(nèi)外對高級別膠質(zhì)瘤治療的臨床預(yù)后仍不盡如人意[10]。腫瘤的發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，越來越多的相關(guān)致病突變基因被研究發(fā)現(xiàn)，目前臨床使用的TMZ 并非對所有高級別膠質(zhì)瘤都有療效，高級別膠質(zhì)瘤的靶向基因治療也亟需個體化進行[11,12]。

圖2 JAZF1 對U87M 細胞侵襲和遷徙的影響

圖3 JAZF1 對侵襲和遷移相關(guān)調(diào)控蛋白表達的影響

JAZF1 是一個核蛋白編碼基因，具有3 個C2H2 樣鋅指結(jié)構(gòu)，對染色穩(wěn)定性維持具有重要作用[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)JAZF1 與子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤、前列腺腫瘤的發(fā)生有關(guān)[5]。本研究在美國腦腫瘤基因庫TCGA_GBMLGG 平臺中查找并分析了JAZF1在膠質(zhì)瘤患者中的表達特征，數(shù)據(jù)計算結(jié)果顯示JAZF1 在不同級別的膠質(zhì)瘤患者中的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平差異，在Ⅳ級膠質(zhì)瘤腫瘤樣本中JAZF1 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著高于Ⅱ、 Ⅲ級膠質(zhì)瘤樣本，而Ⅱ、Ⅲ級膠質(zhì)瘤之間無差別，提示JAZF1 很可能對Ⅳ膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定的調(diào)控作用。眾所周知，GBM 在膠質(zhì)瘤中惡性程度最高，患者的中位生存期較低級別膠質(zhì)瘤患者明顯縮短，而數(shù)據(jù)庫中患者的生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達JAZF1 的膠質(zhì)瘤患者的生存期顯著縮短，進一步說明了JAZF1 在GBM 中有重要的病理生理功能。同時，我科收集的不同級別膠質(zhì)瘤樣本的JAZF1 蛋白水平的差異趨勢和TCGA 數(shù)據(jù)庫膠質(zhì)瘤患者基因檢測中JAZF1的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平差異趨勢一致。隨后將GBM 細胞株U87M 細胞中的JAZF1 表達敲低，相比較于正常U87M 細胞，細胞內(nèi)Akt 蛋白的磷酸化水平顯著降低，并由此進一步抑制了調(diào)控腫瘤細胞侵襲和遷徙相關(guān)蛋白MMP9、MMP2 的表達水平，從而抑制U87M 細胞的侵襲和遷徙能力。本研究結(jié)果證實，JAZF1 可能參與了高級別膠質(zhì)瘤的發(fā)生，并且對高級別膠質(zhì)瘤細胞侵襲和遷徙能力的維持發(fā)揮了重要作用，成為一個新的治療靶點。但是本研究也具有不足之處，目前的研究僅在細胞水平中得到初步研究，分子機制的研究尚淺，可能存在的更多分子信號通路的變化未發(fā)現(xiàn)，還需要進一步深入研究并且在裸鼠成瘤實驗中進行體內(nèi)相關(guān)驗證[14]。

綜上所述，JAZF1 在GBM 中呈高表達，且與患者的生存期呈負(fù)相關(guān)。JAZF1 通過調(diào)控Akt 的磷酸化水平進一步調(diào)控相應(yīng)信號通路下游的MMP9、MMP2 的表達，從而影響GBM 的侵襲和遷徙能力，JAZF1 可能是一個GBM 治療的新靶點。