日光溫室栽培模式下不同種質(zhì)來源人參單體皂苷及氨基酸對比分析

常思佳，寧 雪 ，王日明，楊錄軍 ，任躍英 *（.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春308；.吉林紫鑫紅石種養(yǎng)殖有限公司，通化3535）

東北地區(qū)是人參的道地藥材產(chǎn)區(qū)，學者們對各類新品種人參的育種研究付出了極大的努力。人參皂苷作為人參中最主要的活性成分，皂苷種類、皂苷含量成為人參質(zhì)量評價至關(guān)重要的標準，人參皂苷含量的高低，直接關(guān)系到人參質(zhì)量的優(yōu)劣[1]。而氨基酸對人參植物體增強黑斑病抗病性[2]、調(diào)節(jié)代謝功能有[3]重要作用。

本實驗樣品于吉林省通化市東昌區(qū)金廠鎮(zhèn)龍頭村生產(chǎn)基地采集，供試人參全部栽培于基地日光溫室內(nèi)，為首次采用日光溫室栽培的人參。日光溫室是我國北方特有的一種栽培模式[4～5]。該地區(qū)日光溫室由墻體、支撐骨架及藍色棚膜材料組成，于2014年4月正式于該基地開始首次規(guī)模栽培人參。實驗對該栽培模式下6種種質(zhì)來源的4年生人參利用高效液相色譜法進行20種單體皂苷的提取測定，利用氨基酸自動分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）對16種人參氨基酸含量的進行測定，以區(qū)別其質(zhì)量的優(yōu)劣及是否達到藥典標準，并進一步探討其藥食同源產(chǎn)品化的價值。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗地區(qū)種質(zhì)資源來源情況

野山參I為引種并繁育的第3代品種。第1代2004年7月采于長白山原始森林野生山參，并于2005 年 4 月種植于北崗鎮(zhèn) (127°32′E，42°24′N， 海拔308m)；第2代于2008年7月采種子，于2009年4月繼續(xù)在北崗鎮(zhèn)種植；2013年7月采集第3代種子。

野山參II取自小興安嶺原始森林野山參的育種種質(zhì)，為引種并繁育的的第1代品種。

林下參I為通化地區(qū)二馬牙林下參采種后引種并繁育的第1代。

林下參II為通化地區(qū)長脖林下參采種后引種并繁育的第1代。

園參I為引種并繁育的的大馬牙農(nóng)家品種，作為對照實驗。

園參II為大馬牙與二馬牙雜交的育種后代品系并進行選育繁育，作為對照試驗。

1.1.2 實驗地區(qū)及日光溫室種植的基本情況

本實驗在吉林省通化市東昌區(qū)金廠鎮(zhèn)龍頭村生產(chǎn)基地進行，基地地處北緯 41°36′東經(jīng) 126°0′，海拔500m?；夭扇』炷翂w、鋼管結(jié)構(gòu)支撐架及藍色棚膜組成的半拱形日光溫室生產(chǎn)模式，構(gòu)架長度70 m，跨度8 m，頂寬4 m，墻高3.5 m。1.1.1中6種種質(zhì)資源均于2014年4月正式開始在該基地日光溫室內(nèi)規(guī)模播種繁育。溫室內(nèi)參床垂直于墻體排列，參床高30～40 cm，寬 1.5 m，長 7.5 m，床間作業(yè)道寬 30 cm。播種方式為直播，密度為5′5點播，每平方米400粒，留種田出苗后根據(jù)出苗情況進行補苗、間苗管理，保證每行有12～13株苗。由于該栽培模式特有的各自獨立屬性，基地對于不同種質(zhì)人參的種源保存、花粉隔離具有顯著優(yōu)于傳統(tǒng)伐林栽參、農(nóng)田栽參的模式。

1.1.3 實驗樣品選取

樣品于2017年9月26日在田間進行采集，全區(qū)20%左右植株進入自然枯萎期，判定為該區(qū)域人參的枯萎期初期。經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學任躍英教授鑒定，供試的6個品系均為4年生人參，本實驗取6個品系的人參樣品各5株進行對比及分析。

1.2 實驗儀器

表1 -1主要儀器Tab.1-1 The main instruments

2 實驗方法

2.1 人參皂苷的測定

本實驗對6種種質(zhì)來源人參的20種單體皂苷：Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rh1，Rb2，Rb3，F(xiàn)1，Rd，Rk3，F(xiàn)2，Rh4，Rg3，原人參三醇，Compound K，Rg5，Rh2，原人參二醇利用HPLC色譜法進行測定。

2.1.1 樣品溶液的制備

取6種不同不同種質(zhì)來源的人參各5株，陰干后打粉，過40目篩后，精密稱取待測人參樣品粉末各0.5 g，分別置于10 mL離心管中，每管加入5 mL色譜甲醇溶液，稱取離心管質(zhì)量并記錄，用封口膜密封，超聲提取45 min，靜置過夜。第二天再次稱取離心管質(zhì)量，按所記錄的質(zhì)量用色譜甲醇溶液補足，二次超聲提取 45 min，離心 15 min（5 000 rmin-1），取上清液并過0.45 μm濾膜，所得即為樣品溶液。

2.1.2 人參皂苷的測定及統(tǒng)計

HPLC條件參照楊艷文等[6]所建立的：同時測定人參的20種單體皂苷的方法。進樣量20 μL。

測得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析統(tǒng)計，得出結(jié)果。

2.2 人參氨基酸的測定

本實驗采用氨基酸分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）對種人參的16種氨基酸：天門冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）進行測定。測定方法參照《中華人民共和國國家標準 （食品安全國家標準 食品中的氨基酸的測定）》。

2.2.1 樣品溶液的制備

取6種不同不同種質(zhì)來源的人參各5株，陰干后打粉，根據(jù)蛋白質(zhì)含量分別稱量（約1 g），置于水解管中，加入15 mL 6 molL-1鹽酸溶液、苯酚3～4滴。將水接管放入冷凍機中冷凍5 min，接入真空泵抽氣管抽至真空，然后充入氮氣，重復抽充3次后在氮氣狀態(tài)下封口。將水解管放在110℃±1℃的鼓風恒溫箱中水解22 h后取出，冷卻至室溫。將水解液過濾至50 mL容量瓶內(nèi)，用蒸餾水沖洗水解管，所有溶液一同移入容量瓶，最后用水定容至刻度，振蕩搖勻。精確吸取1 mL濾液至15 mL試管，用平行蒸發(fā)儀在40℃～50℃加熱減壓，干燥后殘留物用1～2 mL水溶解，再減壓干燥，蒸干。用1～2 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液加入到干燥后的試管內(nèi)，混勻后過0.22 μm濾膜，即為待測溶液。

2.2.2 氨基酸的測定及統(tǒng)計

色譜條件：磺酸型陽離子樹脂；檢測波長：570 nm和440 nm。以外標法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸的濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 20種單體皂苷測定結(jié)果

3.1.1 色譜峰歸屬

如圖1-1所示，20種人參皂苷在該條件下均得到良好的分離。

3.1.2 線性關(guān)系考察

圖1 -1人參20種皂苷的標準品色譜圖Fig.1-1 HPLC chromatograms of mixed standard solution

表1 -2人參皂苷的回歸方程Table1-2 Regression equations with correlation coefficients for ginsenosides

如表1-2所示，將皂苷質(zhì)量(y)對峰面積的積分值(x)進行作圖，得到線性回歸方程。20種單體人參皂苷在1.96～20.80 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 （r＞0.999）。

3.1.3 單體皂苷含量測定結(jié)果

供試的6種不同種質(zhì)來源人參均檢測出20種單體皂苷中的13種，如表1-3、圖1-2所示。其中，野參I的總皂苷加和值顯著高于其他品系 (P＜0.05)，達到2.565 1%?？傇碥蘸繌母叩降鸵来螢椋阂皡＞野參 II＞林下參 II＞林下參 I＞園參 I＞園參 II。 在 Rg1 含量組中，野參I顯著高于其他品系(P＜0.05)，且野參II顯著高于林下參II；Re含量野參II均顯著高于其他品系 (P＜0.05)；Rf含量野參I顯著高于其他品系 (P＜0.05)；Rb1含量林下參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rg2含量野參II與林下參I顯著高于林下參II(P＜0.05)；Rc 含量野參 II顯著高于園參品系(P＜0.05)；Rb2含量野參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rb3含量野參I顯著高于林下參及園參品系(P＜0.05)；Rd含量野參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rh4含量林下參I與園參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rg5含量野參I和林下參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rh2含量園參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；原人參二醇含量林下參II顯著高于其他品系(P＜0.05)。根據(jù)2015版《中國藥典》規(guī)定：按人參干燥品計算，含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量不得少于30%，人參皂苷Rb1不得少于0.20%。所有測試樣品均達到藥典標準。

表1 -3 6種種質(zhì)來源人參皂苷含量Table1-3 Ginsenosides Content of ginseng from six germplasm sources %

圖1 -2 6種種質(zhì)來源人參20種皂苷色譜圖Fig.1-2HPLCchromatogramsof20saponinsfrom6germplasmsourcesofginseng

3.2 16種氨基酸測定結(jié)果

3.2.1 色譜峰歸屬

圖1 -3人參16種氨基酸的標準品色譜圖Fig.1-3 Standard map of 16 amino acids of ginseng

3.2.2 氨基酸含量測定結(jié)果

供試的6種不同種質(zhì)來源人參所檢測出的16種氨基酸如表1-4、圖1-4所示。表中所示蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸的含量百分比，野參I均顯著高于其他品系(P＜0.05)；天門冬氨酸含量野參II與林下參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；谷氨酸含量林下參II顯著高于其他品系(P＜0.05)；丙氨酸含量野參I和林下參II顯著高于其他品系(P＜0.05)；亮氨酸含量野參I顯著高于林下參II和園參I、II(P＜0.05)；精氨酸含量野參II顯著高于其他品系(P＜0.05)。其中，野參I的氨基酸總加和值顯著高于其他品系(P＜0.05)。

表1 -4 6種種質(zhì)來源人參氨基酸含量Table1-4 Amino acid content of ginseng from six germplasm sources%

圖1 -4 6種種質(zhì)來源人參16種氨基酸色譜圖Fig.1-416aminoacidchromatogramsof6germplasmsourcesofginseng

4 討論

李海軍[7]等、鐘方麗[8]、張?zhí)m蘭[9]從林下山參中分離出20多種皂苷類化合物。通過不同種質(zhì)人參的皂苷成分含量對比研究發(fā)現(xiàn)，林下山參總皂苷含量(4.6%)低于野山參(7.2%)，但高于園參(3.8%)[10]，林下山參中單體人參皂苷Re含量相對較高，與野山參和園參有顯著性差異(P＜0.01)，平均含量為 5.042 mgg-1[11，12]。 人參中富含多種氨基酸，其種類和數(shù)量因人參品種、參齡、產(chǎn)地、以及人參部位而異，其中人參根所含的氨基酸主要有精氨酸、賴氨酸、丙氨酸等20多種。目前，氨基酸的含量已作為衡量人參產(chǎn)品質(zhì)量的指標之一[13]。張晶等[14]利用HPLC色譜法測定人參根渣中的氨基酸含量。得出結(jié)論：人參樣品中含有15種氨基酸，氨基酸總量達到19.08%，其中6種人體必需氨基酸總量達到9.38%，占氨基酸總量的49.18%。

人參皂苷作為人參具有主要藥用價值的有效成分，其含量的高低直接決定了人參的質(zhì)量及品質(zhì)，而人參中氨基酸的含量，對于人參作為藥食同源產(chǎn)品化進程的推進具有至關(guān)重要的作用。本實驗通過對6種種質(zhì)來源人參皂苷、氨基酸的測定，可看出：在日光溫室栽培模式下，各品系人參的皂苷、氨基酸含量均呈現(xiàn)出較高的數(shù)值，且具有較大的差異。

從20種單體皂苷的測定結(jié)果可見，供試人參均達到2015版《中國藥典》標準。其中，野參I的皂苷總加和值顯著高于其他品系，但各單體皂苷數(shù)值較為平均，在《中國藥典》所規(guī)定的 Rg1、Re、Rb1 含量中，只有Rg1含量顯著高于其他品系，而野參II總皂苷含量僅次于野參I，Re、Rb1含量顯著高于其他參種，可見，供試的兩個野參品系人參均呈現(xiàn)較高的質(zhì)量。林下參品系和園參品系多數(shù)皂苷含量差異不顯著，大多呈現(xiàn)林下參品系＞園參品系的趨勢，或由于林下參和園參共同馴化多年所致，還有待進一步研究。皂苷含量的數(shù)值表明，該地區(qū)以日光溫室栽培模式栽培人參較為合理，且野參品系有較高的數(shù)值表現(xiàn)，具備深入研究與推廣的價值。

從本實驗所測定的16種氨基酸含量可見，供試人參含有的氨基酸較為豐富，含有8種人體必需氨基酸中的7種，且含量較高。各品系人參氨基酸含量的高低各有差異，野參I多數(shù)氨基酸含量指標均顯著高于其他品系，總加和值也顯著優(yōu)于其他品系，具備了推進人參藥食同源產(chǎn)品化的基礎。各品系的氨基酸總含量從高到低依次為：野參I＞野參II＞林下參II＞林下參I＞園參II＞園參I。林下參品系與園參品系總加和值的差異并不顯著。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，人參氨基酸對于人參黑斑病具有明顯的抑制作用[2]，據(jù)此，本實驗結(jié)果也為該栽培模式下不同種質(zhì)來源人參的抗逆性也提供了研究基礎，有待進一步的研究求證。