枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)N—乙酰神經(jīng)氨酸的分離提純

高蘭蘭 袁麗霞 吳金勇

摘要 [目的]對(duì)GRAS認(rèn)證的枯草芽孢桿菌發(fā)酵所得N-乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行分離純化，獲得安全性高的目的產(chǎn)物。[方法]通過沸水浴破壁、菌液分離、活性炭脫色、乙醇分步沉淀除雜、乙酸結(jié)晶以及重結(jié)晶等工藝對(duì)枯草芽孢桿菌基因工程菌株經(jīng)培養(yǎng)所得的N-乙酰神經(jīng)氨酸發(fā)酵液進(jìn)行分離純化。[結(jié)果]分離純化后，N-乙酰神經(jīng)氨酸純度在96.0%以上。[結(jié)論]研究結(jié)果為N-乙酰神經(jīng)氨酸應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域提供了質(zhì)量保障。

關(guān)鍵詞 枯草芽孢桿菌；N-乙酰神經(jīng)氨酸；純化

中圖分類號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0001-02

Abstract [Objective] The aim was to separate and purify of Nacetylneuraminic acid from Bacillus subtilis which has a Generally Recognized as Safe （GRAS） status to get the safe and good production.[Method] After the fermentation of Bacillus subtilis in right medium，Nacetylneuraminic acid，was obtained by eradicating cell wall in boiling water，separating impurity，decolorization process，ethanol precipitation，acetic acid crystallization，recrystallization and other steps.[Result] Through the high performance liquid chromatography （HPLC） detection，the purity of Nacetylneuraminic acid reached above 96.0%.[Conclusion] The results provide reference for the application of Nacetylneuraminic acid in health products and other fields.

Key words Bacillus subtilis；Nacetylneuraminic acid；Purification

N-乙酰神經(jīng)氨酸，又稱唾液酸（簡稱SA），屬于唾液酸家族中最主要的一員。唾液酸是20世紀(jì)50年代最早從頜下腺黏蛋白中分離純化而命名的，帶有極強(qiáng)的負(fù)電荷，是一類含有9個(gè)碳原子且具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖的總稱[1-2]。唾液酸屬于神經(jīng)氨酸的衍生物，廣泛分布在各生物組織內(nèi)，是細(xì)胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分[3]，在許多糖與蛋白相互作用的生理過程中發(fā)揮著重要作用。由于唾液酸中大多數(shù)是N-乙酰神經(jīng)氨酸，僅有少部分是以N-羥乙酰基神經(jīng)氨酸、去氨基神經(jīng)氨酸等形式存在，所以通常所說的唾液酸主要是指N-乙酰神經(jīng)氨酸[4]。N-乙酰神經(jīng)氨酸與人類有著密切的聯(lián)系，能夠促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育，可被應(yīng)用于治療流感、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，與瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移有關(guān)，賦予細(xì)胞抗識(shí)別等眾多生理功能與用途[5-8]，所以被廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)藥品、疾病診斷等領(lǐng)域，如添加到嬰幼兒奶粉中，用于抗流感病毒扎那米韋的研發(fā)。因此，N-乙酰神經(jīng)氨酸具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與應(yīng)用前景。

N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)方法有很多，如天然原料提取法、固定化酶法、全細(xì)胞生物催化法等[9-10]，而微生物發(fā)酵法由于生產(chǎn)成本低，純化工藝相對(duì)簡單，克服了其他方法中存在的純化復(fù)雜、反應(yīng)苛刻、成本高等缺點(diǎn)，成為了近幾年的研究熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外主要是基于大腸桿菌基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的研究，而關(guān)于枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的報(bào)道相對(duì)較少?？莶菅挎邨U菌是GRAS認(rèn)證的安全菌株，遺傳背景清晰、生長速率快、不具有致病性、發(fā)酵及基因操作技術(shù)成熟，并且不易受噬菌體污染[11-12]，是一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株。筆者研究了從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中提取N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，以期獲得安全性高的目的產(chǎn)物，為其應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域提供質(zhì)量保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種?？莶菅挎邨U菌1505-SA-BS-G2-除芽孢由中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院等離子體物理研究所構(gòu)建。

1.1.2 試劑與儀器。N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma Aldrich公司；乙醇：國藥分析純；乙酸：國藥分析純；0.22 μm微孔濾膜：上海半島實(shí)業(yè)有限公司；臺(tái)式離心機(jī)：Allegra X-30R，Beckman公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；正（負(fù)）壓過濾器：海寧市亞泰制藥機(jī)械有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油 20 g/L，酵母粉16 g/L，磷酸二氫鉀 5 g/L，硫酸銨 4 g/L，檸檬酸鈉 2 g/L，七水硫酸鎂 1 g/L，IPTG 2 mmol/L，VB1 0.004 9 g/L，微量元素 1 mL/L（微量元素母液：FeSO4·7H2O 3.500 g/L，MnCl2·4H2O 0.600 g/L，CoCl2·6H2O 0.100 g/L，CuCl2·2H2O 0.065 g/L，H3BO3 0.370 g/L，ZnSO4·7H2O 1.200 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.160 g/L）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)。

用接種環(huán)蘸取少量甘油管菌液，接種至10 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 h，得到一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液1%接種量轉(zhuǎn)接至80 mL 液體LB培養(yǎng)基，同上培養(yǎng)；將微量元素和硫酸鎂的混合液，以及培養(yǎng)5 h的二級(jí)種子液，依次加入到各參數(shù)已穩(wěn)定的5 L發(fā)酵罐中開始培養(yǎng)[pH設(shè)為6.80，通過25%（m/V）的氨水來維持調(diào)節(jié)pH。溫度設(shè)為37 ℃，溶氧保持在30%以上，開始發(fā)酵培養(yǎng)]。

該發(fā)酵采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法，以甘油為主要碳源，發(fā)酵約4 h后甘油耗完，開始補(bǔ)加碳源，發(fā)酵約108 h，最終N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量為8.6 g/L。

1.2.2 N-乙酰神經(jīng)氨酸的分離提純。

1.2.2.1 破壁處理。將培養(yǎng)后的發(fā)酵液盛在敞口的玻璃器皿里，置于恒溫水浴鍋中，沸水浴加熱5 min（加熱過程中要確保攪拌均勻），使菌體細(xì)胞壁充分破壞，胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液體中。

1.2.2.2 菌液分離。將破壁后的發(fā)酵液8 000 r/min離心5 min，收集上清液。

1.2.2.3 活性炭脫色。向上述上清液加入1%活性炭，室溫下攪拌10 min，用0.22 μm膜抽真空過濾，脫掉色素等部分雜質(zhì)。

1.2.2.4 濃縮。將脫色后發(fā)酵液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，50 ℃下進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮至80 g/L左右。

1.2.2.5 除蛋白。向上述濃縮液加入鹽酸，調(diào)節(jié)其pH為3.5，加入1倍體積乙醇溶液，攪拌均勻，靜置后出現(xiàn)白色絮凝狀沉淀（其成分主要為雜蛋白），用微濾膜抽真空過濾，收集上清液。

1.2.2.6 乙醇分步沉淀除雜。繼續(xù)濃縮上述上清液，同時(shí)回收乙醇，將其濃縮至80 g/L左右。重復(fù)上述步驟，調(diào)節(jié)pH后，加入乙醇再次沉淀除雜。

1.2.2.7 乙酸初結(jié)晶。繼續(xù)濃縮分步除雜后的上清液至200 g/L，加入4倍體積乙酸， 4 ℃結(jié)晶24 h。

1.2.2.8 洗滌干燥。用無水乙醇洗滌結(jié)晶后所得的晶體3次，60 ℃烘干至恒重，檢測N-乙酰神經(jīng)氨酸含量。

1.2.2.9 重結(jié)晶。

用4倍體積乙酸對(duì)一次結(jié)晶后的樣品重結(jié)晶，無水乙醇洗滌并烘干，得重結(jié)晶樣品。

1.2.3 N-乙酰神經(jīng)氨酸的檢測。

利用HPLC進(jìn)行檢測樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量。高效液相色譜型號(hào)：島津Lc-15c。

檢測條件：檢測柱 Bio-Rad AMINEX HPX 87H Organic Analysis Column （300.0 mm×7.8 mm） ；柱溫 60 ℃；流動(dòng)相是 6 mmol硫酸，流速0.6 mL/min；檢測波長 210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇分步沉淀法的選擇

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)后的發(fā)酵液比較黏稠，雜質(zhì)較多，濃縮后的發(fā)酵液愈發(fā)黏稠，直接加乙酸結(jié)晶不能達(dá)到純化的目標(biāo)。經(jīng)過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乙醇可除去部分蛋白和雜質(zhì)，但因枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中N-乙酰神經(jīng)氨酸濃度不高，在8～10 g/L，發(fā)酵液大部分是雜質(zhì)，高濃度濃縮后混合液變性成黏性的凝膠狀物質(zhì)，再用乙醇處理很難除去雜質(zhì)。經(jīng)過多次研究發(fā)現(xiàn)，乙醇分步沉淀是一種有效去除蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的方法。首先濃縮液濃縮到80 g/L左右，然后調(diào)pH至3.5，再加入1倍體積乙醇，然后采用微濾膜進(jìn)行過濾。收集濾液，濾液再次蒸發(fā)濃縮，重復(fù)上述步驟，2次沉淀除雜后，即可除去大部分蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。一次乙醇處理后有較多的雜質(zhì)析出，且第2次1倍乙醇處理后仍可觀察到有雜質(zhì)，說明1倍乙醇2次處理的必要性。因此，選用2步1倍乙醇沉淀法進(jìn)行除雜。

2.2 結(jié)晶溶劑及結(jié)晶條件的確定

溶劑結(jié)晶法是生化分離過程中常用的提純方法，微生物發(fā)酵液中，一般含有大量的菌體、蛋白質(zhì)、色素、無機(jī)鹽等雜質(zhì)，這就需要通過各種理化方法對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行提純。利用溶劑結(jié)晶法，可以使雜質(zhì)（結(jié)晶母液中）與產(chǎn)品（固體）分離開來，達(dá)到提純的目的。對(duì)于結(jié)晶溶劑的選擇，理論上應(yīng)根據(jù)提純產(chǎn)物在溶劑中的溶解度、溶劑的介電常數(shù)和溶劑的理化性質(zhì)等來考慮，一般選擇介電常數(shù)小、與水互溶性好的有機(jī)溶劑。通過對(duì)多種溶劑研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雖然乙酸沸點(diǎn)（117.9 ℃）相對(duì)較高，但乙酸介電常數(shù)較小，在20 ℃時(shí)只有6.2，2 ℃時(shí)只有4.1，較小的介電常數(shù)使溶質(zhì)在其中較難解離；同時(shí)乙酸與N-乙酰神經(jīng)氨酸在溶液中帶有相同的電荷，帶有相同電荷的離子在溶液中不可能聚集，只有相互排斥。另外乙酸能夠與水以任意比互溶，且N-乙酰神經(jīng)氨酸也是一種水溶性溶劑，在水中溶解度較大，而N-乙酰神經(jīng)氨酸在乙酸中溶解度卻較小。以上性質(zhì)顯示，且試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，乙酸是一種優(yōu)良的結(jié)晶提純N-乙酰神經(jīng)氨酸的溶劑。

確定了結(jié)晶溶劑，進(jìn)一步對(duì)乙酸結(jié)晶提純的條件進(jìn)行了研究，首先對(duì)濃縮液進(jìn)行濃縮，濃縮后加入不同體積的乙酸進(jìn)行結(jié)晶。結(jié)果表明，當(dāng)加入1～3倍體積的乙酸時(shí)，均未出現(xiàn)結(jié)晶；而加入4～7倍體積的乙酸時(shí)，均出現(xiàn)了結(jié)晶。在4倍體積乙酸條件下，結(jié)晶后N-乙酰神經(jīng)氨酸純度達(dá)68.9%，然而N-乙酰神經(jīng)氨酸的純度并不隨乙酸體積的增加而明顯變化。因此，選擇4倍體積乙酸來進(jìn)行結(jié)晶。

2.3 重結(jié)晶

把純度60.0%～70.0%的晶體進(jìn)行重結(jié)晶。首先把晶體溶于水中，配成濃度200 g/L的水溶液，然后加入4倍體積的乙酸，低溫結(jié)晶。晶體用無水乙醇洗滌，然后烘干檢測。結(jié)果顯示，重結(jié)晶后N-乙酰神經(jīng)氨酸純度均提高到96.0%以上（表1）。

2.4 N-乙酰神經(jīng)氨酸的分離提純工藝流程

對(duì)枯草芽孢桿菌5 L罐發(fā)酵108 h，發(fā)酵液中N-乙酰神經(jīng)氨酸含量為8.6 g/L左右，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)了N-乙酰神經(jīng)氨酸的提取工藝流程（圖1）。

對(duì)發(fā)酵液經(jīng)該工藝流程處理，最后所得N-乙酰神經(jīng)氨酸成品，經(jīng)測定純度均在96.0%以上。

3 結(jié)論

由該研究構(gòu)建的整合性枯草芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)得到的N-乙酰神經(jīng)氨酸發(fā)酵液含N-乙酰神經(jīng)氨酸8～10 g/L，對(duì)該發(fā)酵液進(jìn)行菌液分離、脫色、除雜除蛋白、濃縮、結(jié)晶、重結(jié)晶等分離提純后，可得到純度96.0%以上的N-乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)晶樣品，為大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的分離提純提供技術(shù)方法，為枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]BLIX F G，GOTTSCHALK A，KLENK E.Proposed nomenclature in the field of neura minic and sialic acids[J].Nature，1957，179（4569）：1088.

[2] 劉志東，王蔭榆，郭本恒，等.唾液酸的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2010 （4）：368-373.

[3] MARU I，OHNISHI J，OHTA Y，et al.Why is sialic acid attracting interest now？ Complete enzymatic synthesis of sialic acid with Nacylglucosa mine 2epimerase[J].Journal of bioscience and bioengineering，2002，93（3）：258-265.

[4] 李宏越.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究[D].沈陽：大連工業(yè)大學(xué)，2014.

[5] WANG B.Sialic acid is an essential nutrient for brain development and cognition[J].Annual review of nutrition，2009，29（1）：177-222.

[6] BABU Y S，CHAND P，BANTIA S，et al.BCX1812 （RWJ270201）：Discovery of a novel，highly potent，orally active，and selective influenza neuraminidase inhibitor through structurebased drug design[J].Cheminform，2000，43（19）：3482-3486.

[7] 程鋮，高春芳.唾液酸的生物學(xué)意義及其在肝病中的研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，28（4）：333-336.

[8] HSU C C，LIN T W，CHANG W W，et al.SoyasaponinImodified invasive behavior of cancer by changing cell surface sialic acids[J].Gynecologic oncology，2005，96（2）：415-422.

[9] 李宏越，柳鵬福，史吉平，等.唾液酸的生理功能、應(yīng)用及其生產(chǎn)方法[J].食品工業(yè)科技，2014，35（3）：363-368.

[10] CHEN X，VARKI A.Advances in the biology and chemistry of sialic acids[J].Acs chemical biology，2010，5（2）：163-176.

[11] 劉延峰.代謝工程改造枯草芽孢桿菌高效合成 N-乙酰氨基葡萄糖[D].無錫：江南大學(xué)，2015.

[12] MEYER F M，GERWIG J，HAMMER E，et al.Physical interactions between tricarboxylic acid cycle enzymes in Bacillus subtilis：Evidence for a metabolon[J].Metabolic engineering，2011，13（1）：18-27.