白花丹參內(nèi)生真菌HBG16的抗凝血活性研究

張公安,周 晗,褚翠英,陳 夙,王玉婷,賈汝汝,孫 珂,張 芮,王維維,張顯忠,張景芳,李艷玲

(泰山醫(yī)學院生命科學學院,山東泰安 271016)

心血管疾病是引起人類疾病死亡的主要原因之一,血栓栓塞是心血管疾病最核心的病理過程[1]。目前臨床上采用的抗血栓藥物肝素,近年來發(fā)現(xiàn)不能抑制與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶,這已成為血栓復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[2-5]。隨著人們對其發(fā)病機制研究與認識的不斷深入以及藥物設(shè)計和篩選技術(shù)的日臻成熟,研究安全有效、適于長期服用的抗凝血、抗血栓藥物具有重要意義。

白花丹參(SalviamiltiorrhizaBge.f.alba)是紫花丹參的白花變異種,可有效改善血液流變學指標、降低血液粘稠度、降低血漿纖維蛋白原、抑制血小板聚集、阻止血栓形成、擴張微血管、改善微循環(huán);白花丹參除了有紫花丹參的作用和用途外,對治療血栓閉塞性脈管炎具有獨特療效[6-7]。但由于過度采挖,白花丹參野生資源瀕臨絕跡。因此,尋找一種可行的替代方法來生產(chǎn)這些藥用活性物質(zhì)成為當今的研究熱點。

內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指在植物生活史中某一段時期生活在植物組織內(nèi),對植物沒有引起明顯病害癥狀的真菌[8],能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的藥用活性成分[9]。研究表明,丹參的根及根莖是最常用的活血化瘀中藥之一[6],丹參根中的水溶性成分丹參素、丹酚酸A含有明顯的抗凝血、抗血栓作用[10-13]。前期研究中,課題組從丹參植株內(nèi)采用組織塊分離法得到53株內(nèi)生真菌[14],其中從白花丹參根部分離得到的內(nèi)生真菌HBG16具有較好的抗凝血和抗氧化活性,且HBG16的發(fā)酵液經(jīng)濃縮后,并無明顯抗凝血活性,其抗凝血活性成分主要存在于菌絲體中[15-16]。因此,本文旨在考察HBG16菌絲體的不同溶劑粗提物對家兔的體外凝血時間(CT)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血酶時間(APTT)等的影響,評價HBG16的抗血栓以及抗凝血作用,為研制安全無毒的新型抗凝血類藥物提供新的資源和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康的白花丹參植株(經(jīng)泰山醫(yī)學院藥學院蘇延友教授鑒定為唇形科植物白花丹參(SalviamiltiorrhizaBge.f.alba)) 2015年12月采自萊蕪白花丹參種植基地;實驗用家兔(1.5 kg,3月齡,共50只,雌雄各半) 泰山醫(yī)學院實驗動物中心;葡萄糖(AR)、檸檬酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司;瓊脂粉、肝素 北京索萊寶;無水乙醇(AR)、二甲苯、丙酮(AR) 天津市凱通化學試劑有限公司;甲醇(AR) 上海廣諾化學科技有限公司;乙酸乙酯(AR) 國藥集團化學試劑有限公司;0.9%生理鹽水 辰欣藥業(yè)股份有限公司;凝血酶原時間(PT)測定試劑盒、活化部分凝血酶時間(APTT)測定試劑盒、凝血酶時間(TT)測定試劑盒三種試劑盒 南京建成生物工程研究所。

SW-CJ-ZFⅠ類B型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SPX-25085H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;QYC-2102C全溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;CX31RBSFA電子顯微鏡 OLYMPUS CORPORATION TOKYO JAPAN;JY-92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗凝血活性丹參內(nèi)生真菌HBG16的鑒定 首先按《真菌鑒定手冊》[17]對已經(jīng)分離得到的丹參內(nèi)生真菌HBG16進行初步鑒定。采用改良SDS法提取基因組DNA,通過通用引物對ITS1/ITS4進行PCR擴增。引物:ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)[11]。PCR體系為:10×PCR buffer 5 μL,25 mmol/L MgCl24 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,5 U/μL TaqDNA酶 0.5 μL,正反向引物(10 mmol/L各2 μL,DNA模板4 μL,ddH2O 28.5 mL,共50 μL。PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 1 min,復(fù)性55 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 1.5 min,34個循環(huán),后延伸72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物,通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后,送到上海鉑尚生物科技有限公司測序后,將其序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登陸的序列進行Blast比對,搜索同源序列。采用MEGA 4.0軟件Clustal X 1.81方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 HBG16液體發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物粗提物的制備 挑取內(nèi)生真菌HBG16接種在PDB培養(yǎng)液中,搖床(25 ℃,150 r/min)振蕩培養(yǎng)7 d。6000 r/min離心10 min,收集菌絲體分別使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮進行超聲波萃取3次,固液比為1∶20 g/mL,15 min/次。超聲萃取完成后,萃取液進行合并、濃縮和蒸干后得到粗提的供試品。使用0.9%生理鹽水∶甲醇7∶3 (V/V)作為溶劑,將粗提物配制成10 mg/mL的甲醇粗提物、乙醇粗提物、乙酸乙酯粗提物和丙酮粗提物。

1.2.3 凝血時間(CT)測定 按照表1的順序添加試劑和樣品。每組準備四支試管,分別編號甲、乙、丙、丁,甲試管加入混合液(0.9%生理鹽水∶甲醇=7∶3,V/V)0.5 mL為空白對照;乙試管加入0.2%肝素鈉0.5 mL為陽性對照;丙、丁為兩個重復(fù)試驗,各加入0.5 mL菌絲體粗提物。

表1 CT測定實驗設(shè)計Table 1 Experimental design of measuring clotting time

從家兔固定耳緣靜脈或兔耳中央動脈采血4 mL,自血液進入注射器開始計時,三支試管各加1 mL血樣,充分振搖后,將這些試管放入37 ℃的水浴鍋中。每隔30 s傾斜試管一次,觀察三支試管的血液凝固情況,直至將試管倒置血液不流動為止,取平均值。重復(fù)操作三次。分別測定甲醇粗提物、乙醇粗提物、乙酸乙酯粗提物、丙酮粗提物的凝血時間[18]。

1.2.4 血漿的制備 從家兔耳緣靜脈取血9 mL,緩緩加入含有3.8%的檸檬酸鈉抗凝劑1 mL至離心管中(9∶1,V/V),充分混勻,3000 r/min離心15 min,收集上清液。

1.2.5 凝血酶時間(TT)測定 取出3支試管,分別標記為空白對照組(0.9%生理鹽水)、陽性對照組(0.2%肝素鈉)、實驗組(內(nèi)生菌HBG16菌絲體不同溶劑提取液),按照表2的順序添加試劑和樣品,凝血酶使用之前,放入37 ℃恒溫水浴鍋孵育3 min,加好試劑后立即混勻,開啟秒表,直到有纖維蛋白絲出現(xiàn)時,準確記錄血漿凝固所需的時間,每個樣品重復(fù)5次,計算平均值[18]。

表2 TT測定實驗設(shè)計Table 2 Experimental design of measuring thrombin time

1.2.6 凝血酶原時間(PT)測定 取出3支試管,分別標記為空白對照組(0.9%生理鹽水)、陽性對照組(0.2%肝素鈉)、實驗組(內(nèi)生菌HBG16提取液),按照表3的順序添加試劑和樣品。凝血酶原使用之前,放入37 ℃恒溫水浴鍋孵育3 min,加好試劑后立即混勻,開啟秒表,直到有纖維蛋白絲出現(xiàn)時,準確記錄血漿凝固所需的時間,每個樣品重復(fù)5次,求平均值[18]。

表3 PT測定實驗設(shè)計Table 3 Experimental design of measuring prothrombin time

1.2.7 活性部分凝血酶時間(APTT)測定 取出3支試管,分別標記為空白對照組(0.9%生理鹽水)、陽性對照組(0.2%肝素鈉)、實驗組(HBG16粗提物),按照表4的順序添加試劑和樣品。活化部分凝血酶使用之前,放入37 ℃恒溫水浴鍋孵育3 min,0.025 mol/L CaCl2要在37 ℃水浴中預(yù)熱5 min,加好試劑后立即混勻,開啟秒表,直到有纖維蛋白絲出現(xiàn)時,準確記錄血漿凝固所需的時間,每個樣品重復(fù)5次,求平均值[18]。

表4 APTT測定實驗設(shè)計Table 4 Experimental design of measuring activated partial thromboplastin time

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素實驗分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 HBG16菌株的鑒定

HBG16在PDA固體培養(yǎng)基上的菌落表面呈白色絨狀,生長迅速(圖1)。光學顯微鏡鏡檢,菌絲體無色,小型分生孢子為單胞或雙胞大型分生孢子有少許彎曲,根據(jù)《真菌鑒定手冊》,初步確定為鐮刀菌屬(Fusariumsp.)(圖2)。

圖1 白花丹參內(nèi)生真菌HBG16的菌落特征

圖2 光學顯微鏡下HBG16的形態(tài)特征(40×)

ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對后,選擇同源性高于97%的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3),結(jié)果發(fā)現(xiàn),HBG16與FusariumoxysporumKC869371.1、F.oxysporumKU364076.1和F.oxysporumKU170715.1聚在同一分支中,它們ITS序列的相似性達到99%。因此,將丹參內(nèi)生真菌HBG16鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

圖3 丹參內(nèi)生真菌HBG16的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 HBG16菌絲體不同溶劑粗提物對家兔CT的影響

HBG16菌絲體甲醇粗提物對家兔CT的影響結(jié)果見表5。從表中可以看出,家兔血液體外環(huán)境中,在沒有添加任何抗凝劑的空白對照組中(357.50±20.00) s即凝固;陽性對照組血液不凝;菌株HBG16菌絲體甲醇、乙醇、丙酮粗提物組血液同樣不凝,與陽性對照組效果相同;但是乙酸乙酯粗提物組對家兔CT無明顯延長效果。

表5 HBG16菌絲體粗提物對家兔CT(s)的影響Table 5 Effects of HBG16 mycelium extract on clotting time

2.3 HBG16菌絲體不同溶劑粗提物對家兔TT的影響

HBG16菌絲體粗提物對家兔TT的影響結(jié)果見表6。從表中可以看出,空白對照在(24.67±0.67) s時出現(xiàn)纖維蛋白絲,肝素鈉的陽性對照組對家兔TT具有極顯著延長作用(p<0.01);HBG16發(fā)酵菌絲甲醇粗提物、無水乙醇粗提物對家兔TT均有顯著延長作用(p<0.05),丙酮粗提物組的TT極顯著延長。但乙酸乙酯粗提物對家兔TT無顯著延長作用(p>0.05)。

表6 HBG16菌絲體粗提物對家兔TT的影響Table 6 Effects of HBG16 mycelium extracts on thrombin time

2.4 HBG16菌絲體不同溶劑粗提物對家兔PT的影響

HBG16菌絲體不同溶劑粗提物對家兔PT的影響結(jié)果見表7。從表中可以看出,陰性對照在(19.00±2.00) s時出現(xiàn)纖維蛋白絲,肝素鈉的陽性對照組對家兔PT具有極顯著延長作用(p<0.05),加入HBG16發(fā)酵菌絲甲醇粗提物組對家兔PT具有顯著延長作用(p<0.05),而無水乙醇粗提物、乙酸乙酯粗提物、丙酮粗提物樣品組對家兔PT無明顯延長作用(p>0.05)。

表7 HBG16號菌的發(fā)酵液粗提物對家兔對PT的影響Table 7 Effects of HBG16 mycelium extracts on prothrombin time

2.5 HBG16菌絲體不同溶劑粗提物對家兔APTT的影響

HBG16菌絲體不同溶劑粗提物對家兔APTT的影響結(jié)果見表8。從表中可以看出,陰性對照在(136.80±1.40) s時出現(xiàn)纖維蛋白絲,加入肝素鈉的陽性對照組對家兔APTT具有極顯著延長作用(p<0.01);HBG16發(fā)酵菌絲甲醇粗提物極顯著延長家兔APTT(p<0.01),乙酸乙酯粗提物樣品組顯著延長家兔APTT(p<0.05)。而無水乙醇和丙酮粗提物對家兔APTT無明顯延長作用(p>0.05)。

表8 HBG16菌絲體粗提物對家兔對APTT的影響Table 8 Effects of HBG16 mycelium extracts on activated partial thromboplastin time

3 結(jié)論與討論

本研究從白花丹參根中分離到一株具有抗凝血活性的內(nèi)生真菌HBG16,采用形態(tài)學和分子方法,鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。HBG16菌絲體甲醇、乙醇和丙酮粗提物可以顯著延長家兔的凝血時間(CT)、凝血酶時間(TT)以及活化部分凝血酶時間(APTT),但是對凝血酶原時間(PT)沒有明顯效果,說明其抗凝途徑可能為內(nèi)源性抗凝血途徑。

內(nèi)生真菌由于其次生代謝過程的復(fù)雜性和所處環(huán)境的特殊性,可產(chǎn)生與宿主成分藥理相同或相似的一些結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的化學成分。丹參作為活血化瘀中藥的代表,在治療心腦血管疾病方法發(fā)揮著重要的作用。研究已證明,丹參的水溶性成分丹參素、丹酚酸A具有明顯的抗凝血和抗血栓作用,在抑制血栓形成和保護心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要的藥理作用[10-13]。因此可以推測丹參內(nèi)生真菌菌絲體中可能會有某種單體或一類化合物參與凝血過程的某個步驟,這一步驟阻止時,血液不能凝固,從而抑制凝血過程,產(chǎn)生抗凝作用。

凝血過程是一系列的酶促作用的結(jié)果,該過程可以分為外源性凝血途徑(extrinsic pathway,EP)、內(nèi)源性凝血途徑(intrinsic pathway,IP)和共同凝血途徑(common pathway,CP)。內(nèi)源性凝血途徑是指凝血因子Ⅻ與表面的接觸因子或者激活肽釋放酶相互接觸從而被激活,直到形成因子Ⅹa的過程;外源性途徑是指組織因子與Ⅶa結(jié)合后直至形成因子Ⅹa的過程;共同途徑則指的是從因子Ⅹa形成到形成纖維蛋白的過程,是內(nèi)源途徑和外源共同的作用過程[19-20]。根據(jù)血漿聚集狀態(tài)的重要檢測指標PT、TT和APTT,具體分析凝血過程是哪條凝血途徑的酶促作用的結(jié)果;這三者是各自獨立的基礎(chǔ)性凝血途徑篩選指標,分別反應(yīng)了內(nèi)源性凝血途徑、外源性凝血途徑和共同凝血途徑的凝血狀態(tài)。其中,PT是反映外源性凝血途徑的指標,內(nèi)源系統(tǒng)凝血酶的抑制與TT和APTT的延長有關(guān)[18,21]。下一步我們將對粗提物進行分離純化進而確定其結(jié)構(gòu)功能與活性成分,并對其具體的抗凝血機制進行深入研究。