張 穎,閆慧明,彭德舉,何亮亮,曹 煒,*
(1.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安 710069;2.寶雞眾羊生態(tài)牧業(yè)有限公司,陜西寶雞 722400)
羊乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易于消化吸收且具有諸多保健功能,是公認(rèn)比牛乳更接近人乳的營(yíng)養(yǎng)佳品。我國是羊乳生產(chǎn)大國,2010年羊乳年產(chǎn)量達(dá)27.75萬噸,世界排名第13位(FAO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù))。關(guān)中奶山羊作為我國特有奶山羊品種,主要集中在陜西關(guān)中地區(qū),占據(jù)了我國羊乳90%以上產(chǎn)量,羊乳產(chǎn)業(yè)已成為陜西第二大優(yōu)勢(shì)和特色產(chǎn)業(yè)[1]。但目前市場(chǎng)上羊乳制品品類單一,主要以羊乳粉為主,在產(chǎn)品開發(fā)和基礎(chǔ)研究方面極其落后,嚴(yán)重制約了羊乳產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。
乳在加熱時(shí)會(huì)發(fā)生一系列物理化學(xué)變化,如風(fēng)味變化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失、褐變、蛋白質(zhì)變性、酸度、粘度、脂肪球大小等,從而對(duì)乳制品感官品質(zhì)和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[2-3]。與牛乳相比,羊乳對(duì)加熱更加敏感,穩(wěn)定性差,在熱加工過程中尤其高溫處理下更容易出現(xiàn)變性、沉淀,成為制約液體羊乳尤其常溫長(zhǎng)保質(zhì)期液態(tài)羊乳生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)難題[4-6]。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)羊乳加熱過程已進(jìn)行一定研究,張富新等[5]探究了不同因素對(duì)羊乳酪蛋白熱凝固時(shí)間的影響;趙麗麗[6]比較了65~137 ℃/7 s六種短時(shí)熱處理后羊乳酸度、粘度、乳清蛋白變性度、沉淀量和穩(wěn)定性指數(shù)的差異;Pesic 等[7]分析了90 ℃/10 min加熱后羊乳中的熱誘導(dǎo)蛋白聚合物。然而,目前相關(guān)研究局限于幾種溫度工藝下的熱處理,羊乳在乳制品實(shí)際加工中常用熱殺菌條件處理下品質(zhì)的變化規(guī)律尚未見系統(tǒng)比較。
因此,本研究采用乳品工業(yè)中5種常見熱殺菌方式,即低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、高溫短時(shí)巴氏殺菌(72 ℃/15 s)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)、超高溫瞬時(shí)滅菌(137 ℃/7 s)和高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)處理關(guān)中羊乳,在測(cè)定羊乳蛋白沉淀率、酒精穩(wěn)定性、pH、紅度值、粘度和脂肪球變化的基礎(chǔ)上,結(jié)合內(nèi)源熒光光譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,探究熱加工對(duì)關(guān)中羊乳品質(zhì)的影響,以期為液態(tài)羊乳加工技術(shù)研究和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。
生鮮羊乳 寶雞眾羊生態(tài)牧業(yè)有限公司;低分子量蛋白質(zhì)Marker(14.4~97.4 kDa) 北京索萊寶科技有限公司;丙烯酰胺、N,N-亞甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基甲烷、甘氨酸、硝酸銀、無水碳酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等 均為國產(chǎn)分析純。
HH-S4電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;GYB60-6s高壓均質(zhì)機(jī) 上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠;HWCL-3油浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;DSX-280KB24高壓殺菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;Five Easy Plus pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DYCZ-24雙垂直蛋白電泳儀 北京六一儀器廠;BK-FL2熒光顯微鏡 奧特光學(xué)有限公司;NDJ-5S旋轉(zhuǎn)粘度計(jì) 上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司;Infinite M200PRO酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司;NS800分光測(cè)色計(jì) 深圳三恩馳科技有限公司。
1.2.1 羊乳的預(yù)處理及熱殺菌處理 生鮮羊乳驗(yàn)收合格后(符合國標(biāo)GB19301-2010,其中蛋白含量3.05%,脂肪含量3.27%),對(duì)其進(jìn)行真空冷凍干燥成粉末,于-18 ℃保存待用。實(shí)驗(yàn)前稱取一定量羊乳凍干粉,與蒸餾水1∶7 (w/w)比例混合,40 ℃水浴30 min使之充分復(fù)原,然后進(jìn)行高壓均質(zhì)(均質(zhì)溫度50~60 ℃;均質(zhì)壓力一級(jí)20 MPa,二級(jí)5 MPa),再分別采用65 ℃/30 min、72 ℃/15 s、95 ℃/5 min、121 ℃/20 min和137 ℃/7 s 5種不同熱殺菌方式處理羊乳,殺菌結(jié)束后立即采用流動(dòng)冷水將其冷卻至室溫,以未經(jīng)殺菌處理的羊乳作為對(duì)照,待分析。
1.2.2 熱殺菌處理后羊乳蛋白沉淀率、酒精穩(wěn)定性、pH、紅度值和粘度的測(cè)定
1.2.2.1 蛋白沉淀率的測(cè)定 參考趙麗麗[6]的方法測(cè)定羊乳蛋白沉淀率??针x心管質(zhì)量記為m0,向離心管中加入10 mL熱殺菌處理后的羊乳樣品,稱其總質(zhì)量,記為m1。于4 ℃下4000 r/min離心20 min,除去上層脂肪,吸出脫脂乳備用,倒置5~10 min后,再次稱其質(zhì)量記為m2。羊乳離心沉淀率計(jì)算公式如下:
離心沉淀率(%)=(m2-m0)/(m1-m0)×100
式中:m0為空離心管質(zhì)量,g;m1為離心管加乳樣質(zhì)量,g;m2為離心管加底層沉淀質(zhì)量,g。
1.2.2.2 酒精穩(wěn)定性的測(cè)定 參考趙麗麗[6]的方法測(cè)定熱殺菌處理后羊乳的酒精穩(wěn)定性。取1 mL羊乳樣品與1 mL不同濃度酒精(60%、68%和72%)混勻,室溫下在玻璃皿中觀察是否有絮凝沉淀。
1.2.2.3 pH的測(cè)定 在25 ℃下用pH計(jì)測(cè)定熱殺菌處理后的羊乳樣品的pH。
1.2.2.4 粘度的測(cè)定 取30 mL熱殺菌處理后的羊乳樣品放于測(cè)量杯中,選用粘度計(jì)0 # 轉(zhuǎn)子,在室溫(25 ℃)和剪切速率(60 r/min)下,測(cè)定樣品粘度,測(cè)量一次完畢后,旋轉(zhuǎn)30 °左右再進(jìn)行第二次測(cè)量,共測(cè)定8次,取平均值為樣品粘度。
1.2.2.5 紅度值的測(cè)定 采用全自動(dòng)測(cè)色儀測(cè)定熱殺菌處理后羊乳樣品的紅度值a*,使用前首先進(jìn)行黑白校正,然后取10 mL樣品放于測(cè)量杯中進(jìn)行測(cè)定,每次測(cè)定時(shí)羊乳樣品加入量保持一致。
1.2.3 羊乳脂肪球的顯微鏡觀察 參考孫琦[8]方法觀察羊乳脂肪球。取少許羊乳樣品于潔凈載玻片中央,蓋上蓋玻片,滴適量香柏油,置于1000×光學(xué)顯微鏡下觀察羊乳脂肪球大小和形態(tài)。
1.2.4 羊乳蛋白內(nèi)源熒光光譜分析 參考李子超等[9]的方法,并進(jìn)行適當(dāng)修改,分析羊乳蛋白的內(nèi)源熒光光譜。羊乳樣品脫脂后用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋20倍,然后取200 μL稀釋后的樣品,點(diǎn)樣在酶標(biāo)儀熒光專用96孔黑板上,選取激發(fā)波長(zhǎng)λex271 nm,手動(dòng)增益值45,閃光數(shù)5次,步寬2 m,測(cè)定樣品在300~500 nm范圍的熒光發(fā)射光譜。
1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 參考Chevallet等[10]方法進(jìn)行羊乳蛋白SDS-PAGE分析。采用4%濃縮膠和12%分離膠,將不同熱殺菌羊乳脫脂后用蒸餾水稀釋15倍,與樣品緩沖液1∶1混合,沸水加熱3~5 min后,上樣8 μL。凝膠電泳電壓開始設(shè)定為80 V,待進(jìn)入分離膠后調(diào)整為120 V。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀氨染色,終止顯色后拍照,并采用Qutity one軟件進(jìn)行蛋白條帶光密度分析。
試驗(yàn)重復(fù)三次,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,且p<0.05認(rèn)為存在差異顯著。
熱殺菌是乳品加工中不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié),適宜的熱處理是保證乳制品流通中質(zhì)量穩(wěn)定和符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的必要條件[3]。根據(jù)熱處理工藝參數(shù)不同,常見乳殺菌方式有低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、高溫短時(shí)巴氏殺菌(72~75 ℃/15 s)超巴氏殺菌(80~95 ℃/5~10 min)、高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)和超高溫瞬時(shí)滅菌(137~140 ℃/4~10 s)。
2.1.1 5種常見熱殺菌方式對(duì)羊乳蛋白沉淀率的影響 5種熱殺菌對(duì)羊乳蛋白沉淀率影響程度存在明顯差異,如表1所示。其中高溫短時(shí)巴氏殺菌(72 ℃/15 s)影響最小,蛋白沉淀率與未加熱相比增加不顯著(p>0.05);其次為低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)和超高溫瞬時(shí)滅菌(137 ℃/7 s),蛋白沉淀率與未加熱相比均顯著增加,但三者之間差異不顯著(p<0.05);而高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)則導(dǎo)致蛋白沉淀率最高。這表明熱處理強(qiáng)度越大,羊乳蛋白沉淀率越高,熱穩(wěn)定性越低。Raynal-Ljutovac等[11]認(rèn)為,加熱會(huì)引起羊乳酪蛋白膠束表面疏水性變化,這是改變羊乳熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。另外,羊乳缺乏αs1-酪蛋白,使乳清中自由鈣離子含量較高,且羊乳蛋白粒度明顯大于牛乳,這些均導(dǎo)致羊乳蛋白比牛乳對(duì)熱更加敏感,經(jīng)熱處理后沉淀率較高[4,6]。
表1 常見熱殺菌方式對(duì)羊乳蛋白沉淀率、酒精穩(wěn)定性、pH、紅度值和粘度的影響Table 1 Effect of common thermal sterilization methods on centrifugal precipitation rate, alcohol stability,pH,color value and viscosity of goat milk
2.1.2 5種常見熱殺菌方式對(duì)羊乳酒精穩(wěn)定性的影響 由表1可知,在60%酒精濃度下,酒精穩(wěn)定性試驗(yàn)均呈陰性,說明5種熱殺菌羊乳在60%酒精濃度下均穩(wěn)定;在68%酒精濃度下,僅高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)沉淀明顯,說明高溫高壓滅菌羊乳在68%酒精濃度下不穩(wěn)定;而在72%酒精濃度下,酒精穩(wěn)定性均呈陽性,說明5種熱殺菌羊乳在72%酒精濃度下均不穩(wěn)定。乳品加工中常用酒精穩(wěn)定性試驗(yàn)檢驗(yàn)乳新鮮度,從而反應(yīng)乳體系的穩(wěn)定狀況,一般牛乳采用72%酒精、羊乳采用68%酒精來進(jìn)行。研究認(rèn)為,熱處理羊乳的酒精穩(wěn)定性變化與加熱過程中酪蛋白水化作用和電荷變化有關(guān)[12-13]。本研究表明,羊乳的酒精穩(wěn)定性隨著熱處理強(qiáng)度增大而顯著降低,高溫高壓滅菌對(duì)羊乳酒精穩(wěn)定性破壞最大,蛋白沉淀率也最高,說明高溫高壓滅菌下羊乳內(nèi)部穩(wěn)定體系會(huì)發(fā)生顯著變化,可能預(yù)示著高溫高壓滅菌不適合于液態(tài)羊乳制品加工。
2.1.3 5種常見熱殺菌方式對(duì)羊乳pH、壓紅度值和粘度的影響 由表1也可看出,低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、低溫短時(shí)巴氏殺菌(72 ℃/15 s)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)和超高溫瞬時(shí)滅菌(137 ℃/7 s)對(duì)羊乳pH和紅度值影響不顯著,而高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)則導(dǎo)致pH顯著下降、紅度值顯著增加(p<0.05),但5種殺菌工藝對(duì)粘度均沒有顯著影響(p>0.05)。加熱時(shí),乳中可溶性鈣磷向膠體性鈣磷轉(zhuǎn)變、乳糖受熱降解、美拉德反應(yīng)發(fā)生等,均可導(dǎo)致體系pH降低[14]。美拉德反應(yīng)隨熱處理強(qiáng)度增大而加劇,尤其高溫條件下乳中發(fā)生美拉德反應(yīng)的蛋白質(zhì)種類以及蛋白質(zhì)美拉德位點(diǎn)數(shù)均會(huì)大幅增加,褐變程度加劇,從而導(dǎo)致紅度值升高[15]。pH下降和紅度值增加預(yù)示著乳品質(zhì)的變劣,本研究表明高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)對(duì)羊乳品質(zhì)影響較大。
脂肪球微粒大小對(duì)乳的外觀、口感和穩(wěn)定性有著重要影響[16]。采用光學(xué)顯微鏡觀察5種殺菌方式羊乳中脂肪球的差異,如圖1所示。與未加熱相比,低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、低溫短時(shí)巴氏殺菌(72 ℃/15 s)和超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)后羊乳脂肪球表觀直徑略微增大,而高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)和超高溫瞬時(shí)滅菌(137 ℃/7 s)的高強(qiáng)度殺菌,則導(dǎo)致羊乳脂肪球直徑減小,尤以高溫高壓滅菌減小更加明顯。這與周潔瑾等[17]對(duì)牛乳的研究結(jié)果相似,巴氏殺菌牛乳脂肪球因聚集而變大,而超高溫滅菌牛乳脂肪球破裂、直徑變小。在加熱過程中,乳脂肪球膜會(huì)通過二硫鍵吸附變性乳清蛋白造成脂肪球表觀直徑增大,但在高強(qiáng)熱處理時(shí),發(fā)生脂肪球膜破裂和脂肪球變形,導(dǎo)致其直徑減小[16-19]。
色氨酸(Trp)殘基是蛋白質(zhì)中重要的內(nèi)源熒光來源,Trp中生色團(tuán)對(duì)其所處微環(huán)境極性非常敏感,因此利用蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜的變化可以反映其三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[20]。圖2顯示的是5種殺菌方式處理羊乳的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜,從圖2可以看出,與未加熱相比,5種熱殺菌方式處理均導(dǎo)致羊乳蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度(If)增大,但低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、低溫短時(shí)巴氏殺菌(72 ℃/15 s)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)和超高溫瞬時(shí)滅菌(137 ℃/7 s)僅使If微弱升高,且四種殺菌羊乳內(nèi)源熒光圖譜非常接近,而高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)則導(dǎo)致羊乳蛋白If劇烈增大。內(nèi)源熒光強(qiáng)度增加說明5種熱殺菌使羊乳蛋白中Trp所處環(huán)境極性減小,Trp分子內(nèi)猝滅減弱,從而導(dǎo)致體系If增大,并且高溫高壓滅菌對(duì)羊乳蛋白結(jié)構(gòu)影響最大,羊乳蛋白中有更多Trp分子暴露于疏水環(huán)境[21]。
圖2 常見熱殺菌方式對(duì)羊乳蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜的影響
圖3所示的是5種常見熱殺菌方式羊乳蛋白質(zhì)經(jīng)銀氨染色后SDS-PAGE圖譜。與牛乳一樣,羊乳主要含有酪蛋白和乳清蛋白兩類蛋白,其中酪蛋白又分為β-酪蛋白(β-CN)、αs1-酪蛋白(αs1-CN)、αs2-酪蛋白(αs2-CN)和κ-酪蛋白(κ-CN),乳清蛋白則包括β-乳球蛋白(β-LG)、α-乳白蛋白(α-LA),此外,還存在微量的免疫球蛋白(LgG)、乳鐵蛋白(LF)和血清白蛋白(BSA)(圖3)。
圖3 常見熱殺菌方式對(duì)羊乳蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜的影響
由圖3可以看出,與未加熱相比,低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、低溫短時(shí)巴氏殺菌(72 ℃/15 s)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)和超高溫瞬時(shí)滅菌(137 ℃/7 s)對(duì)β-CN條帶影響不明顯,高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)則使其光密度微弱減小;αs1-CN、αs2-CN和κ-CN在巴氏殺菌和超巴氏殺菌處理下變化不大,然而在高溫高壓滅菌和超高溫瞬時(shí)滅菌條件下,αs1-CN和αs2-CN發(fā)生明顯降解,尤其以高溫高壓滅菌降解程度最大,而κ-CN在超高溫瞬時(shí)滅菌下發(fā)生聚集,在121 ℃/20 min下則出現(xiàn)更明顯的蛋白聚合和碎片。對(duì)于β-LG,低溫短時(shí)巴氏殺菌處理時(shí)無明顯變化,低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌和超巴氏殺菌下略有減少,但在高溫高壓滅菌和超高溫瞬時(shí)滅菌后則明顯降解,尤其高溫高壓滅菌時(shí)降解更多;而對(duì)于α-LA,超高溫瞬時(shí)滅菌下同樣出現(xiàn)明顯降解,但在高溫高壓滅菌強(qiáng)熱處理時(shí)則幾乎完全消失(圖3)。另外,對(duì)于高溫高壓滅菌和超高溫瞬時(shí)滅菌,50 kDa以上以及14.4~22 kDa區(qū)間出現(xiàn)明顯蛋白聚合物或碎片,高溫高壓滅菌更為明顯(圖3)。整體來看,巴氏殺菌對(duì)羊乳酪蛋白和乳清蛋白影響均較小,超巴氏殺菌乳清蛋白開始變性、聚集或部分降解,而超高溫瞬時(shí)滅菌和高溫高壓滅菌下乳清蛋白明顯降解甚至消失,酪蛋白表現(xiàn)出明顯的聚集和解聚現(xiàn)象,尤其高溫高壓滅菌時(shí)變化最為劇烈。
目前,關(guān)于羊乳在加熱過程中尤其高溫處理下乳蛋白變化機(jī)制研究非常有限,而牛乳相關(guān)研究表明,牛乳酪蛋白含有較高比例脯氨酸,其會(huì)阻止熱變性凝固所必需氫鍵的形成,因而對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定;乳清蛋白對(duì)加熱比較敏感,加熱首先使β-LG變性,然后變性β-LG通過二硫鍵等方式與酪蛋白微粒結(jié)合,當(dāng)加熱溫度達(dá)到80 ℃以上時(shí),α-LA開始變性與酪蛋白發(fā)生結(jié)合,且隨加熱溫度升高更多α-LA和β-LG絡(luò)合于酪蛋白膠體表面;高熱處理下(120~140 ℃)酪蛋白膠束體系嫡發(fā)生改變,氫鍵破壞,疏水性增強(qiáng),膠束發(fā)生聚合或者解聚作用[22-23]。Henry等[24]研究發(fā)現(xiàn),80 ℃/10 min和115 ℃/20 s熱處理下羊乳酪蛋白膠束和β-LG之間會(huì)形成三種共價(jià)鍵。Pesic等[7]研究90 ℃/10 min加熱牛、羊乳中的熱誘導(dǎo)蛋白聚合物時(shí),發(fā)現(xiàn)兩種乳中變性β-LG、a-LA、κ-CN在乳清相和酪蛋白膠束相分布存在明顯差異。這預(yù)示著羊乳蛋白雖與牛乳一樣在低強(qiáng)度加熱時(shí)發(fā)生變性,高強(qiáng)熱處理時(shí)出現(xiàn)聚集和解聚,牛、羊乳蛋白質(zhì)在熱加工過程中的變化存在相似之處,但羊乳蛋白在加熱過程中具體的變性、解聚和聚合機(jī)制仍有待深入研究。
本文研究了5種乳品工業(yè)中常用熱殺菌方式對(duì)關(guān)中羊乳品質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):高溫高壓滅菌羊乳蛋白沉淀率最高、酒精穩(wěn)定性最差、pH明顯下降、紅度值明顯增大。5種殺菌方式對(duì)粘度沒有顯著影響(p>0.05);羊乳脂肪球經(jīng)巴氏殺菌后表觀直徑略微增大,而超高溫瞬時(shí)滅菌和高溫高壓滅菌則導(dǎo)致其直徑明顯變小,高溫高壓滅菌更為明顯。熒光光譜表明,羊乳經(jīng)不同熱殺菌后蛋白空間結(jié)構(gòu)改變存在差異,其中高溫高壓滅菌后內(nèi)源熒光強(qiáng)度劇烈增大。SDS-PAGE顯示,巴氏殺菌對(duì)羊乳酪蛋白和乳清蛋白影響均較小,超巴氏殺菌乳清蛋白開始變性、聚集或部分降解,而超高溫瞬時(shí)和高溫高壓滅菌下,則導(dǎo)致乳清蛋白明顯降解甚至消失,酪蛋白出現(xiàn)聚集和解聚,高溫高壓殺菌更為明顯。由此可見,高溫高壓滅菌和超高溫瞬時(shí)滅菌,尤其是高溫高壓滅菌對(duì)關(guān)中羊乳品質(zhì)影響較大,超巴氏殺菌影響次之,而巴氏殺菌則對(duì)其影響較小。