二輪鹽漬工業(yè)泡菜微生物群落結構解析

汪冬冬，陳功,2，李恒,2，唐垚，萬鵬，張其圣,2*

(1.四川東坡中國泡菜產業(yè)技術研究院，四川 眉山 620000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院， 成都 611130；3.四川省川南釀造有限公司，四川 眉山 620000)

利用食鹽對新鮮蔬菜進行漬制加工而成的蔬菜制品，稱之為鹽漬菜。泡菜是鹽漬菜中的一種，在我國尤以四川泡菜最具代表性，其品種繁多，風味獨特，得利于適宜的氣候條件和豐富的蔬菜資源[1,2]。泡菜發(fā)酵是微生物群落的種類和數(shù)量不斷演替變化的過程，是多種微生物相互作用的復雜過程，其以活性乳酸菌群主導發(fā)酵。

四川泡菜在工業(yè)化生產過程中，由于加工的需要，蔬菜需要進行發(fā)酵和后期成熟的過程。在工業(yè)生產泡菜中尤其是二輪發(fā)酵工藝最有代表性。該工藝將新鮮蔬菜采用低鹽快速發(fā)酵，當產品酸度達到一定程度以后，快速翻池，進入第二輪發(fā)酵與后熟儲存的過程。產品在第一輪發(fā)酵過程中由于鹽度低(一般鹽度低于5%)、發(fā)酵速度快，可以快速消除蔬菜本身的生味，進入成熟期。根據(jù)加工的需要，第一輪發(fā)酵后的蔬菜制品可以直接進入后續(xù)工段加工成為泡菜，也可以在進行第二次高鹽度儲存發(fā)酵(一般大于8%)，實現(xiàn)周年加工的目的。經過第二輪發(fā)酵的產品，由于發(fā)酵時間長、風味好，往往更容易受到消費者的喜愛。

微生物的發(fā)酵作用可能是導致第一輪發(fā)酵與第二輪發(fā)酵蔬菜制品品質差異的主要原因。針對第一輪低鹽發(fā)酵過程的產品已經有大量的報道，乳桿菌屬主導了整個發(fā)酵過程。如田偉等[3]利用16S rRNA分析傳統(tǒng)四川發(fā)酵泡菜中的細菌多樣性，其中Lactobacillus和Pediococcus兩個屬，所占比例分別為88.4%和10.1%。李正國采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和DGGE法檢測榨菜中乳桿菌屬是優(yōu)勢菌群。翁佩芳等[4]發(fā)現(xiàn)榨菜腌制初期優(yōu)勢菌群為腸膜明串珠菌, 隨后轉變?yōu)橹参锶闂U菌和短乳桿菌占優(yōu)勢，腌制后期主要為植物乳桿菌等。然而針對第二輪高鹽儲存過程中，認識有較大差異，如在細菌方面，一些人認為該發(fā)酵過程中以乳桿菌為主導發(fā)酵[5]；另外一些人則認為泡菜是以乳桿菌主導發(fā)酵，但也發(fā)現(xiàn)了大量的芽孢桿菌[6]；一些學者發(fā)現(xiàn)高鹽鹽漬發(fā)酵的蔬菜制品也有報道以芽孢桿菌屬(Bacillus)為主導[7]。Liang H采用高通量測序的方法研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus主導榨菜發(fā)酵中段，以Lactobacillus和Pediococcus為主[8]。在真菌方面，羅青春等研究了規(guī)模泡菜中，蘿卜、豇豆、青菜和榨菜的主要優(yōu)勢酵母菌分別為Debaryomyces；Debaryomyces和Starmerella；Debaryomyces；Starmerella，Debaryomyces和Candida[9]。尹禮國采用DGGE發(fā)現(xiàn)不同鹽漬青菜樣品的優(yōu)勢真菌與假絲酵母屬、德巴氏酵母屬、接合酵母屬的菌株相似[10]。張先琴發(fā)現(xiàn)季也蒙假絲酵母在泡菜發(fā)酵真菌中占主導[11]；Liang H采用高通量測序的方法研究發(fā)現(xiàn)Debaryomyces是榨菜的主導真菌。

從目前的研究來看，對傳統(tǒng)泡菜中微生物菌群結構研究較多，而二輪高鹽發(fā)酵泡菜少有報道，且大多數(shù)有關泡菜中微生物的研究多集中在乳酸菌方面。本研究采用可培養(yǎng)方法，探討二輪高鹽發(fā)酵泡菜中微生物群落結構，為進一步對微生物進行深入研究，尤其對高鹽蔬菜制品特有的風味品質，構建微生物與品質之間的關聯(lián)具有重要的意義，以期為后續(xù)優(yōu)化泡菜生產工藝，實現(xiàn)人工控制泡菜發(fā)酵過程奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

泡菜原料為發(fā)酵1年以上的鹽漬豇豆(J)、鹽漬青芥菜(Q)、鹽漬蘿卜(L)，取自四川眉山某泡菜廠鹽漬池；PCA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限公司；Bacterial DNA Isolation Kit、2×PCR Mix(ForegeneTaq DNA聚合酶、dNTPs、Tris-HCl、KCl、MgCl2)：成都福際生物技術公司；Biomiga EZgene TM Fungal gDNA Miniprep Kit：美國Biomiga公司；瓊脂糖：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇：成都市科龍化工有限公司；PCR引物(見表1)：成都擎科梓熙生物技術有限公司。

表1 PCR引物表Table 1 PCR primer list

1.2 儀器與設備

DHP-9080B恒溫培養(yǎng)箱、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀、HH-4恒溫水浴鍋 成都智誠科靈儀器儀表有限責任公司；TGL-20BR臺式冷凍離心機、T960梯度PCR熱循環(huán)儀、IY04S-3E型凝膠成像分析系統(tǒng)、PHS-3C型精密pH計 成都一科儀器設備有限公司；BL SMART型拍打式均質機 意大利ASTORI公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 pH、總酸與鹽度的測定

依據(jù)GB 10648—1989《水果和蔬菜產品pH值的測定方法》測定泡菜的pH；按照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定樣品中的總酸含量，結果以乳酸計；依據(jù)GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》中滴定法測定泡菜的食鹽濃度。

1.3.2 微生物計數(shù)

將25 g泡菜加入到含有225 mL無菌生理鹽水的均質袋中，用拍擊式均質器拍打2 min，勻漿后進行1∶10梯度稀釋，制成樣品菌懸液。取適當稀釋度的菌懸液分別接入不同培養(yǎng)基中涂布培養(yǎng)后計數(shù)，平行重復3次，取其平均值。其中PCA培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)48 h，PDA培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)48 h，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對照。觀察不同培養(yǎng)基中典型菌落的菌落形態(tài)、個體形態(tài)和染色特征，劃線法分離純化各菌株。

1.3.3 菌相分析

1.3.3.1 細菌16S rDNA序列測定

菌株DNA的提取參照細菌DNA提取試劑盒(Bacterial DNA Isolation Kit)說明書方法進行。PCR體系(50 μL)：2×PCR Mix 25 μL，模板DNA 1.5 μL，引物27F(10 μmol/L)和1492R(10 μmol/L)各2 μL，加雙重蒸餾水補充至50 μL。反應程序參照Haruta等[12]的方法進行。

1.3.3.2 真菌26S rDNA序列測定

菌株DNA的提取參照試劑盒方法(Biomiga EZgene TM Fungal gDNA Miniprep Kit)進行。PCR反應體系(50 μL)組成：2×PCR Mix 25 μL，模板DNA 1.5 μL，引物NL1(10 μmol/L)和NL4(10 μmol/L)各2 μL，加雙重蒸餾水補齊50 μL。反應程序參照Tofalo等[13]的方法進行。

1.3.3.3 序列測定

PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，細菌目標條帶為1500 bp左右，真菌目標條帶為600 bp左右。將符合16S rDNA和26S rDNA片段大小的PCR擴增產物送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，測序結果利用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

本研究實驗數(shù)據(jù)通過Excel 2007軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)導入Origin 9.1中作圖進行比較，菌相構成采用PermutMatrix進行heatmap和聚類分析，同時采用Sorensen similarity index評價不同泡菜樣品細菌和真菌的相似程度，并通過biodap進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 泡菜一般性質

本研究中的4種不同原料泡菜樣品全部為發(fā)酵1年以上，其pH、總酸和鹽度見表2。

表2 4種不同原料泡菜樣品理化指標測定結果Table 2 Determination resuts of physicochemical indexes of four pickle samples with different raw materials

由表2可知，4種不同原料泡菜pH處于3.59～4.06之間，一般認為pH<4表示泡菜發(fā)酵完成[14]；總酸含量都大小0.5 g/100 g，一般認為酸度在0.5%～0.8%左右，泡菜質量最好；鹽度都大小12 g/100 g，屬于高鹽發(fā)酵，這與高鹽有利于鹽漬菜長時間儲存的工藝有關。表明該階段泡菜環(huán)境已經形成一定的緩沖體系，較穩(wěn)定。

4種不同原料泡菜的細菌和真菌菌落總數(shù)情況見圖1，菌落總數(shù)都小于105CFU/mL，此時，微生物作用對泡菜影響較小，且蘿卜、豇豆、榨菜中細菌都低于真菌總數(shù)。在鹽漬泡菜發(fā)酵后期，在高鹽條件下，微生物受低pH和高酸度的影響，大部分死亡或被抑制，存留少部分耐鹽且耐酸的微生物。

圖1 4種不同原料泡菜菌落數(shù)Fig.1 Colony number of four pickles with different raw materials

2.2 細菌群落構成

4種不同原料泡菜樣品中共分離出細菌93株，鹽漬豇豆、鹽漬蘿卜、鹽漬青菜、鹽漬榨菜分別鑒定出28，21，19，25株。經鑒定，93株菌分為6個屬，分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、虛構芽孢桿菌屬(Fictibacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。4種不同原料泡菜中芽孢桿菌占主導，分別占到78.1%、100.0%、78.9%、62.5%。這與報道中的泡菜發(fā)酵后期乳桿菌占主導不一致，這可能與鹽漬泡菜后期長時間貯藏有關。經過二輪加鹽長時間貯存，在高鹽、低pH、高酸條件下，泡菜中大部分微生物生長受到抑制和死亡，存留的乳酸菌都耐鹽耐酸。工業(yè)化的泡菜都為自然發(fā)酵，粗獷式生產，芽孢桿菌多數(shù)來源于原料表面或環(huán)境，其對外界有害因子抵抗力強，生命力強，在乳酸菌減少的情況下逐漸占據(jù)優(yōu)勢。

從屬水平上分析，可以把鹽漬豇豆和鹽漬青菜分為1類，鹽漬蘿卜和鹽漬榨菜各分為1類，具體分析見圖2A。細菌分為6個屬，包含20個種，鹽漬豇豆中占6種，占主導的為高地芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis，46.4%)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，17.9%)。鹽漬蘿卜中占10種，占主導的為壁芽孢桿菌(Bacillusmuralis，23.8%)、高地芽孢桿菌(B.altitudinis，23.8%)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium，14.3%)。鹽漬青菜中占10種，占主導的為高地芽孢桿菌(B.altitudinis，26.3%)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium，21.1%)和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus，10.5%)。鹽漬榨菜中占8種，占主導的為消化乳桿菌(Lactobacillusalimentarius，29.2%)、高地芽孢桿菌(B.altitudinis，29.2%)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium，20.1%)，4種不同原料泡菜樣品細菌群落結構詳見圖2B。

細菌通過相似度分析，除了鹽漬榨菜和青菜、鹽漬榨菜和蘿卜相似性較差外，其余泡菜間相似性都大于0.7，差異小，說明泡菜發(fā)酵到后期，經過環(huán)境對菌群的“自凈化”，原料種類對細菌影響較小，見表3。

圖2 四個不同原料泡菜細菌heatmap圖Fig.2 Heatmap diagram of bacteria in four pickles with different raw materials

相似性系數(shù)JLQZJ10.7810.8870.823L10.7890.625Q10.719Z1

泡菜發(fā)酵到后期，由于酸度和低pH的原因，微生物數(shù)量較少，此階段發(fā)酵微弱，處于發(fā)酵貯藏階段。泡菜在貯藏過程中，由于受到環(huán)境或者人為因素的影響，泡菜的品質會逐漸降低，出現(xiàn)軟化、“生花”等腐敗現(xiàn)象，這主要與腐敗微生物有關。本實驗鑒定細菌多數(shù)來源于蔬菜的表面和環(huán)境，具有耐酸耐鹽能力，這些菌與鹽漬發(fā)酵泡菜品質降低相關。其中，蔡炯等[15]研究了腐敗泡菜中甲級營養(yǎng)型芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等是腐敗泡菜中主要的微生物。王猛等[16]發(fā)現(xiàn)腐敗泡菜中出現(xiàn)甲級營養(yǎng)型芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。

2.3 真菌群落構成

4種不同原料泡菜樣品中共分離出真菌71株，其中鹽漬豇豆、鹽漬蘿卜、鹽漬青菜、鹽漬榨菜分別鑒定出26，20，17，8株。經鑒定，71株真菌分為7個屬，分別為Millerozyma、畢赤酵母屬(Pichia)、布勒擲孢酵母屬(Bullera)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、假絲酵母屬(Candida)。鹽漬豇豆中假絲酵母屬為優(yōu)勢菌，占到76.9%；鹽漬蘿卜中德巴利氏酵母屬和接合酵母屬占主導，分別占到55.0%和20.0%；鹽漬青菜中假絲酵母屬和畢赤酵母屬占主導，分別占到70.6%和23.5%；鹽漬榨菜中假絲酵母屬和德巴利氏酵母屬占主導，分別占到75.0%和25.0%。

圖3 四個不同原料泡菜真菌heatmap圖Fig.3 Heatmap map of four pickles fungi with different raw materials

從屬水平上分析，可以把鹽漬豇豆和鹽漬榨菜分為1類，鹽漬蘿卜和鹽漬青菜各分為1類，具體分析見圖3A。

真菌7個屬的菌株與以下8個種比較相近，其中鹽漬豇豆占5種，占主導的為蜂生假絲酵母(Candidaapicola)，占到76.9%；鹽漬蘿卜中占4種，占主導的為漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和二孢結合酵母(Zygosaccharomycesbisporus)，分別占到55.0%、20.0%；鹽漬青菜中占4種，占主導的為埃切假絲酵母(Candidaetchellsii)和膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)，分別占到55.8%、23.5%；鹽漬榨菜中占2種，煉乳假絲酵母(Candidalactiscondensi)和漢遜德巴利酵母(D.hansenii)占主導，分別占到75.0%、25.0%，該結果與羅青春等人的研究結果相一致。4種不同原料泡菜樣品細菌群落結構見圖3B。

真菌通過相似度分析，豇豆與榨菜較相似，蘿卜與青菜相似性較差，說明不同原料種類泡菜后期真菌群落結構不同，該結果和聚類分析相一致，見表4。

表4 四個不同原料泡菜樣品真菌相似性Table 4 Fungi similarity of four pickle samples with different raw materials

有機酸形成酸性環(huán)境，有利于發(fā)酵蔬菜的貯藏，其對腐敗微生物具有抑制作用[17]。泡菜在發(fā)酵后期，乳酸菌生長受到抑制，數(shù)量降低，且乳酸被一些酵母消耗[18-23]。酵母菌在泡菜發(fā)酵過程中能產生乙醇，一定量的條件下可增加泡菜的風味，其與有機酸等結合生成酯類等香氣。酵母菌在厭氧的條件下能產生芳樟醇、苯乙醇等萜類物質，還產生乙酸乙酯等酯類香氣[24]。

其中德巴利氏酵母是泡菜中常見的一種酵母，利用大量糖進行繁殖產生乙醇、3-甲基-1-丁醇等物質[25]；球擬酵母可產生烷基苯酚類香味物質，漢遜氏酵母發(fā)酵力強，能產生乙酸乙酯[26]，這可能是二輪鹽漬泡菜比一次鹽漬泡菜香氣更足的原因。同時也發(fā)現(xiàn)，泡菜存在的假絲酵母、畢赤酵母是泡菜中典型的腐敗酵母，大量研究報道這些微生物與泡菜產生浮膜、腐敗等有關[27-29]。

3 結論

通過可培養(yǎng)方法結合16S rDNA和26S rDNA序列鑒定技術，對四川工業(yè)化二輪鹽漬泡菜中細菌和真菌群落結構進行分析。結果表明：長時間儲存的工業(yè)化鹽漬泡菜pH低、酸度和鹽度高，微生物數(shù)量都小于105CFU/mL，發(fā)酵程度微弱。4種不同原料泡菜中細菌分離鑒定出93株菌，總共6個屬20個種，4種不同原料泡菜芽孢桿菌屬占主導，豇豆、蘿卜、青菜和榨菜的主要優(yōu)勢細菌為B.altitudinis和B.subtilis；B.muralis，B.altitudinis和B.megaterium；B.altitudinis，B.megaterium和B.methylotrophicus；L.alimentarius，B.altitudinis和B.megaterium。真菌共分離鑒定出71株菌，共分為7個屬8個種，豇豆、蘿卜、青菜和榨菜的主要優(yōu)勢真菌為Candida；Debaryomyces和Zygosaccharomyces；Candida和Pichia；Candida和Debaryomyces。其中Bacillus，Candida，Pichia等是降低泡菜品質的腐敗微生物，可能與長時間鹽漬發(fā)酵泡菜品質逐漸降低有關，同時二輪鹽漬發(fā)酵泡菜中存在球擬酵母和漢遜氏酵母等增香酵母，這與二輪鹽漬泡菜比一次鹽漬泡菜香有關。不同原料泡菜在后熟階段細菌差異較小，真菌差異較大，此結果揭示了四川工業(yè)化二輪鹽漬泡菜長時間儲存后微生物群落結構，為企業(yè)生產和研發(fā)耐鹽耐酸的直投式菌劑提供了參考價值。