低糖腌制韭菜根中優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定

胡秀虹，張廷輝，李建會，李培,3，王翔,3*

(1.凱里學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011；2.黔東南州食品藥品檢驗檢測中心， 貴州 凱里 556011；3.黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心，貴州 凱里 556011)

腌韭菜根是用寬葉韭(AlliumhookeriThwaites)的肉質(zhì)根拌以鹽、糖等輔料加工制成的產(chǎn)品。寬葉韭又稱大葉韭，百合科蔥屬多年生宿根性植物，是以根莖為主要食用部位的韭菜，原產(chǎn)于云、貴、川和西藏[1,2]。貴州黔東南麻江縣“壩芒”牌腌韭菜根是以糖粉、辣椒面等為輔料，在無任何防腐劑、色素添加下，經(jīng)傳統(tǒng)的腌制工藝加工而成，其營養(yǎng)價值豐富，具有特殊的辛香味，是一款本土特色食品[3]。

目前，腌韭菜根的生產(chǎn)還處于作坊式加工狀態(tài)，生產(chǎn)環(huán)境條件差、生產(chǎn)技術(shù)相對落后且缺乏相應(yīng)的操作規(guī)范，故在加工生產(chǎn)中，往往易造成產(chǎn)品質(zhì)量不統(tǒng)一、貨架期短等問題。袋裝腌韭菜根，由于是低糖腌制，又不加任何防腐劑，在貯、運、銷過程中易被微生物污染，發(fā)生脹袋變質(zhì)。故本研究以脹袋變質(zhì)的真空包裝韭菜根為原料，從中分離篩選出優(yōu)勢腐敗菌，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析鑒定出引起真空包裝韭菜根脹袋變質(zhì)的主要微生物，以期為腌韭菜根的生產(chǎn)工藝及微生物污染的有效控制提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

低糖腌制韭菜根：由貴州麻江裕沃生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：均購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增引物：購于上海生工生物工程股份有限公司；生理生化試劑：均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗原材料檢測

以脹袋變質(zhì)的低糖腌制韭菜根為供試樣品，參照GB 10468—89，采用酸度計測定樣品pH；參照GB/T 12456—2008，采用酸堿滴定法測定樣品總酸度；參照GB 5009.8—2016，采用酸水解法測定樣品總糖含量；參照GB 2714—2015進行樣品感官檢查。

1.2.2 腐敗菌的菌落分離純化

選取真空包裝后出現(xiàn)腐敗變質(zhì)的低糖腌制韭菜根，在無菌操作下，稱取25 g，剪碎，放入裝有225 mL無菌生理鹽水的滅菌均質(zhì)袋中，均質(zhì)器拍擊均質(zhì)5 min(拍擊速度為8次/s)，制成樣品勻液，梯度稀釋至適宜濃度，吸取0.1 mL于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布均勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，從中挑取典型單菌落并反復(fù)進行平板劃線分離，得到純化的單菌落菌株，編號并保存。

1.2.3 優(yōu)勢腐敗菌的篩選

將分離純化得到的各菌株平板活化12 h，挑起菌體用無菌水制成菌懸液，使菌體濃度約為105～106cfu/mL。將滅菌后的韭菜根浸于菌懸液中，5 s后取出晾干，置于無菌袋中真空包裝，以未接腐敗菌的韭菜根作對照，37 ℃恒溫保存。從是否發(fā)生脹袋及韭菜根感官變化方面進行比較，以使韭菜根樣品較快腐敗的接種菌株作為優(yōu)勢腐敗菌。

1.2.4 優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

采用平板涂布法將各菌株分別接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)，參照《微生物學(xué)實驗教程》進行革蘭氏染色和芽孢染色[4]，參照文獻[5]制備細菌掃描電鏡樣品，觀察菌體形態(tài)，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行生理生化特性試驗[6]。將各菌株分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，8000 r/min離心收集菌體。按照細菌基因組DNA提取試劑盒方法分離純化菌株基因組DNA。根據(jù)原核生物16S rRNA保守序列通用引物：27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492r(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)，以各菌株的基因組DNA為模板，對該菌株的16S rDNA進行PCR擴增。擴增反應(yīng)體系(25 μL)：基因組DNA 0.5 μL，10×buffer(with Mg2+) 2.5 μL，引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，Tras DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，加雙蒸H2O至25 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，測序結(jié)果按文獻[7]方法進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗原材料檢測

以不發(fā)生腐敗變質(zhì)的腌韭菜根為對照，對脹袋變質(zhì)的腌韭菜根(見圖1)進行總酸、總糖及感官分析檢測，結(jié)果見表1。

圖1 腌韭菜根脹袋變質(zhì)前后對比Fig.1 Comparison of pickled Chinese chives roots before and after bag bulging and deterioration

組別pH總酸(g/100 g)總糖(g/100 g)感官分析對照組6.28～6.440.12～0.1833.06～33.15正常色澤(淡黃色)、辛香氣味、蔥辣味濃、有韌性、飽滿脹袋組4.53～4.670.19～0.2735.23～35.28色澤暗,黑褐色、刺鼻酸敗味、蔥辣味淡、軟焉、不飽滿

由表1可知，真空包裝低糖腌制韭菜根在流通貯藏期間，發(fā)生脹袋變質(zhì)的腌韭菜根酸度、總糖含量均下降，產(chǎn)品的外觀色澤、辛香氣味、質(zhì)感及口感均發(fā)生明顯變化。

2.2 優(yōu)勢腐敗菌的分離篩選

將腐敗變質(zhì)的低糖腌制韭菜根均質(zhì)液通過稀釋涂布及劃線法分離得到17株單菌落，經(jīng)純化制成菌液，接種至無菌韭菜根中進行致腐實驗，通過脹袋及感官評定比較，發(fā)現(xiàn)接種菌株XB3、XB5、XB7、XB8的韭菜根樣品腐敗較快。將這些致腐能力較強的菌株作為優(yōu)勢菌，進一步研究其形態(tài)學(xué)特性、生理生化特性及種屬關(guān)系。

2.3 優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

2.3.1 優(yōu)勢腐敗菌的形態(tài)及生理生化鑒定

各菌株的掃描電鏡結(jié)果見圖2，圖2中的A，B，C，D分別表示菌株XB3、XB5、XB7、XB8。

由圖2可知，XB3菌體呈桿狀，末端鈍圓，菌體表面光滑、無鞭毛、無纖毛，產(chǎn)芽孢；XB5菌體呈短桿狀，末端鈍圓，菌體表面光滑、無鞭毛、無纖毛，產(chǎn)芽孢；XB7菌體呈桿狀或近球狀，菌體表面光滑、無鞭毛、無纖毛，產(chǎn)芽孢；XB8菌體呈長桿狀，菌體表面光滑有內(nèi)陷、無鞭毛、無纖毛，產(chǎn)芽孢。

圖2 腐敗菌的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 Scanning electron microsgroph of spoilage bacteria

各株腐敗菌的部分形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗結(jié)果分別見表2和表3。

表2 腐敗菌的形態(tài)學(xué)特征Table 2 Morphology characteristics of spoilage bacteria

注：“+”表示有；“-”表示沒有。

表3 腐敗菌的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria

注：++表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；+-表示產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；-+表示不產(chǎn)酸產(chǎn)氣；--表示不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；+表示陽性反應(yīng)；—表示陰性反應(yīng)；(+)表示弱陽性反應(yīng)；(—)表示弱陰性反應(yīng)。

由表2可知，4株腐敗菌的菌落形態(tài)具有明顯差異，均屬于產(chǎn)芽孢桿菌，除XB7外，其余3株菌革蘭氏陽性。由表3可知，所有腐敗菌株接觸酶反應(yīng)陽性，表明其能產(chǎn)生過氧化氫酶；XB5能液化明膠，表明該菌株具有較強的水解蛋白質(zhì)的能力；XB3、XB5和XB7表現(xiàn)出甲基紅反應(yīng)陽性，表明這些菌株可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸；XB3在葡萄糖、蔗糖發(fā)酵中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；XB5在葡萄糖發(fā)酵中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但在蔗糖、乳糖發(fā)酵中產(chǎn)酸產(chǎn)氣；XB7在蔗糖發(fā)酵中產(chǎn)酸產(chǎn)氣；XB8在葡萄糖發(fā)酵中不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在蔗糖、乳糖發(fā)酵中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。分析結(jié)果表明，具有產(chǎn)氣能力的菌株可能是引起韭菜根產(chǎn)品脹袋的主要腐敗菌，產(chǎn)酸菌株可能是導(dǎo)致韭菜根酸敗異味的主要腐敗菌，產(chǎn)酶菌株可能會導(dǎo)致韭菜根軟化。

2.3.2 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析和分子鑒定

以菌株的總DNA為模板，用細菌16S rRNA序列通用引物進行PCR擴增，其產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3。

圖3 腐敗菌的16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 16S rRNA PCR products of spoilage bacteria

1，2，3，4泳道分別表示菌株XB3、XB5、XB7和XB8的16S rRNA基因的PCR擴增產(chǎn)物；MK為DNA Marker。由圖3可知，其序列長度大約在1500 bp。經(jīng)測序，菌株XB3、XB5、XB7和XB8的序列長度分別為1504，1515，1481，1497 bp，均符合細菌16S rRNA序列長度。將其與數(shù)據(jù)庫中同源性較高的模式菌株進行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株XB3與Bacilluscereus親緣關(guān)系最近，菌株XB5與Bacillusmegaterium親緣關(guān)系最近，菌株XB7與Acinetobacterlactucae親緣關(guān)系最近，菌株XB8與Paenibacillusamylolyticus親緣關(guān)系最近，相似度均大于99%。因此，由分子生物學(xué)鑒定結(jié)果結(jié)合菌落形態(tài)特征及生理生化特性可判定，從腐敗韭菜根中分離的腐敗細菌XB3為B.cereus，XB5為B.megaterium，XB7為A.lactucae,XB8為P.amylolyticus。

圖4 基于16S rRNA基因序列同源性的4株腐敗菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees of four spoilage bacteria based on 16S rRNA sequence homology

3 結(jié)論

微生物生長繁殖是導(dǎo)致真空包裝腌韭菜根脹袋變質(zhì)的主要原因，脹袋的韭菜根無論是酸度、總糖還是色澤、氣味、口感等感官品質(zhì)均大大下降。本研究從發(fā)生脹袋變質(zhì)的低糖腌制韭菜根中分離篩選到4株優(yōu)勢腐敗細菌，經(jīng)鑒定，主要由B.cereus，B.megaterium，A.lactucae和P.amylolyticus構(gòu)成。芽孢桿菌是脹袋變質(zhì)腌韭菜根中的主要腐敗菌屬，其中B.megaterium和A.lactucae可能是引起韭菜根脹袋的主要腐敗菌株，B.megaterium，B.cereus，P.amylolyticus和A.lactucae在一定程度上均能導(dǎo)致韭菜根產(chǎn)生酸敗異味、發(fā)黑、軟化等變質(zhì)現(xiàn)象。該研究有望為解決貴州黔東南州本土特色食品——腌韭菜根在生產(chǎn)和貯藏過程中出現(xiàn)的脹袋變質(zhì)問題提供參考，也為下一步天然防腐劑的篩選應(yīng)用及滅菌工藝的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。