固定化紅曲酯化酶處理新醋提高其品質(zhì)的研究

張媛淵，王如福，郎繁繁，侯紅萍*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801； 2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，太原 030400)

早在20世紀50年代就有了固定化酶技術(shù)，即用固體材料將酶束縛或限制在一定的空間內(nèi)，但其仍能進行特有的催化反應，并可回收及重復使用的一類技術(shù)，相比傳統(tǒng)的游離酶更有優(yōu)勢，穩(wěn)定性好，易與底物及反應物分離，可維持酶活力等[1，2]。固定化酶技術(shù)被廣泛應用于食品、制藥、生物和化學分析、環(huán)境保護等各個領域[3-8]。載體材料的選擇對制備固定化酶尤為重要，選擇某種惰性材料，對酸、堿、溫度等環(huán)境條件具有一定的耐受性。

山西老陳醋有顏色較深、醋液清亮、氣香醇厚等特點，傳統(tǒng)的山西老陳醋經(jīng)過“夏日曬，冬撈冰”的方法進行陳釀，時間長達9～12個月，可制得老陳醋，傳統(tǒng)陳釀方法有較多的缺點，如：占地面積廣，不易管理，環(huán)境不佳等，所以人工催陳食醋技術(shù)備受關(guān)注，主要有物理法和化學法[9-11]。而生物酶法在醋中的應用尚未可見，利用酶加速催化醋的陳化是新的研究方向。

本試驗采用包埋法固定化紅曲酯化酶，將其應用于食醋中，促進酯化反應，提高品質(zhì)。對食醋企業(yè)的發(fā)展有提升經(jīng)濟效益的作用，有廣闊的應用前景。

1 材料和方法

1.1 原料和試劑

原料：山西紫林醋業(yè)股份有限公司。

紅曲酯化酶(食品級，10萬/活力單位)：武漢佳成生物制品有限公司；食品級黃原膠(XG)、食品級瓜爾豆膠(GG)、食品級卡拉膠(CG)、食品級海藻酸鈉(SA)、α-萘酚、α-乙酸萘酯、SDS、無水碳酸鈉、固藍B鹽。

1.2 儀器和設備

ST3100實驗室pH計 奧豪斯儀器有限公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；JJ124BC型萬分之一電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠；B11-3型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酯化酶酶液制備

稱取1 g酶粉，用pH 3.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液充分溶解，將酶液用100 mL容量瓶定容。再用定性濾紙將其過濾，得到酯化酶酶液，置于4 ℃冰箱中冷藏[12]。

1.3.2 游離酯化酶活力測定

圖1 α-萘酚標準曲線Fig.1 Standard curve of α-naphthol

參考文獻[13，14]的方法改進：移取 0.25 mL酯化酶液, 加入磷酸緩沖液 4.25 mL，然后加入0.25 mL 0.1 mg/mL α-乙酸萘酯溶液, 于40 ℃恒溫水浴定時反應10 min, 然后加入 0.25 mL 3% SDS水溶液終止反應, 再加入0.25 mL 0.05%的固藍B鹽溶液顯色，混勻計時 30 s時加入 0.25 mL 6 mol/L的鹽酸溶液使顯色穩(wěn)定, 同時把酶液換成蒸餾水的溶液作空白, 用分光光度計檢測并記錄數(shù)據(jù)。

用紫外分光光度計掃描α-萘酚以及固藍B鹽與 α-萘酚形成絡合物的吸收曲線，在525 nm處有最大吸收峰，選擇 525 nm為最佳測定波長。繪制α-萘酚標準曲線，見圖1。

1.3.3 固定化酯化酶活力的測定

準確稱取一定質(zhì)量的固定化酶顆粒，根據(jù)游離酯化酶活力的測定方法測定固定化酯化酶的活力。

1.3.4 相對酶活力的計算

相對酶活是按同組最高酶活為參考，計算出的酶活比值為相對酶活，設定同組最高酶活力的相對酶活，計為100%。

1.3.5 固定化酯化酶的制備

載體材料：海藻酸鈉(SA)、黃原膠(XG)、瓜爾豆膠(GG)、卡拉膠(CG)。

載體濃度：以載體溶液總體積30 mL 計，設定復合凝膠質(zhì)量濃度為0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4 g/dL，載體比例1∶1或1∶1∶1 ，稱取膠體，在 60 ℃ 以下溫水溶解，室溫下加入6 mL 酯化酶液，攪拌均勻，放入40 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)至膠體中無殘留的氣泡。 使用 10 mL無菌注射器，以約1 滴/s的速度，將凝膠滴入質(zhì)量濃度為2.4%的CaCl2溶液中，在 4 ℃ 冰箱中固化 2.0 h之后將載體顆粒濾出，再用乙酸-乙酸鈉緩沖液沖洗除去表面的CaCl2溶液。擦干載體顆粒表面的水分， 得到固定化酶顆粒，在0～4 ℃ 下保存?zhèn)溆谩?/p>

在此基礎上，采用單因素輪換法，依次考察載體比例3∶2(3∶1∶1)、2∶1(4∶1∶1)、5∶2(5∶1∶1)、3∶1(6∶1∶1)，固定化時間(1.5，2，2.5，3，3.5，4 h)、固定化液濃度(1.8%、2.4%、3%、3.6%、4.2%、4.8%)和酶液添加量(3，4，5，6，7，8 mL)測定相對酶活力。

1.3.6 固定化酯化酶條件的響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)響應面Box-Benhnken的中心組合設計原理，以固定化載體濃度(X1)、固定時間(X2)、酶液添加量(X3)為影響因素，相對酶活力(Y)為響應值進行響應面優(yōu)化，試驗因素與水平見表1。

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of test

1.3.7 固定化酯化酶操作半衰期的研究

取一定量的固定化酶測定初始酶活力，以乙酸乙酯為底物進行反應，做2組重復，每隔2天測定1次。假定活力損失與時間成指數(shù)關(guān)系， 半衰期用下式表達：

式中：E為反應初始時的酶活U;Et為反應t時刻的酶活U。

1.3.8 食醋主要理化指標的測定

總酸的測定參考GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》；氨基酸態(tài)氮的測定參考GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》；不揮發(fā)酸的測定參考GB/T 18187—2000《釀造食醋》；還原糖的測定參考GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品 山西老陳醋》；總酯的測定參考GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品 山西老陳醋》。

1.3.9 固定化酯化酶應用于食醋

將制備好的固定化酶顆粒加入100 mL食醋中促進其酯化反應。固定化酯化酶的添加量為6，9，12 g；控制作用溫度分別為35，40，45 ℃；分別測定在12，24，36，48 h的總酯含量。并根據(jù)響應面法優(yōu)化試驗確定加入最佳固定化酶量、作用時間及作用溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酯化酶條件的確定

2.1.1 載體的濃度對固定化酯化酶相對酶活力的影響

載體濃度對固定化酯化酶相對酶活力的影響結(jié)果見圖2。

圖2 載體的濃度對固定化酯化酶活力的影響Fig.2 Effect of carrier concentration on activity of immobilized esterase

由圖2可知，SA-XG-CG和SA-XG隨著載體濃度的增加，相對酶活力逐漸增加，當濃度達到2.1 g/dL時相對酶活達到最大值，分別為99.86%和94.14%，當濃度>2.1 g/dL時，相對酶活力逐漸下降；SA-CG、SA-GG、SA-XG-GG、SA-CG-GG隨著載體濃度的增加，相對酶活力也逐漸增加，當濃度達到1.8 g/dL時相對酶活達到最大值，分別為88.92%、95.91%、95.48%、93.01%。故選擇SA-XG和SA-XG-CG的最佳載體濃度為2.1 g/dL；SA-CG、SA-GG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳載體濃度為1.8 g/dL。

2.1.2 載體比例對固定化酯化酶相對酶活力的影響

載體比例對固定化酯化酶相對酶活力的影響見表2。

表2 載體比例對固定化酯化酶活力的影響Table 2 Effect of carrier ratio on activity of immobilized esterase

由表2可知，當SA-XG、SA-CG、SA-GG、SA-XG-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的載體比例分別為3∶1、5∶2、3∶1、4∶1∶1、4∶1∶1、5∶1∶1時，相對酶活力較高，分別為74.56%、100%、82.88%、79.37%、86.17%、90.15%。因此選擇3種酶活力較高的載體組合為SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG，且比例分別為5∶2、4∶1∶1、5∶1∶1。

2.1.3 固定化時間對固定化酯化酶相對酶活力的影響

固定化時間對固定化酯化酶相對酶活力的影響見圖3。

圖3 固定化時間對固定化酯化酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization time on activity of immobilized esterase

由圖3可知，隨著固定化時間的增加，相對酶活力逐漸增加，SA-CG在2.5 h達到最大值94.24%，當時間>2.5 h時，相對酶活力呈下降趨勢；SA-XG-GG與SA-CG-GG在3 h達到最大值99.56%和85.44%；當時間>3 h時，相對酶活力呈下降趨勢。因此選擇SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳固定化時間分別為2.5，3，3 h。

2.1.4 固化液濃度對固定化酯化酶相對酶活力的影響

固化液濃度對固定化酯化酶相對酶活力的影響見圖4。

圖4 固化液濃度對固定化酯化酶活力的影響Fig.4 Effect of solidified liquid concentration on activity of immobilized esterase

由圖4可知，隨著固定化時間的增加，相對酶活力先增加后減小，SA-CG在2.4 g/dL達到最大值99.87%，當濃度>2.4 g/dL時，相對酶活力呈下降趨勢；SA-XG-GG與SA-CG-GG在3 g/dL達到最大值98.98%和95.78%；當濃度>3 g/dL時，相對酶活力呈下降趨勢。因此選擇SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳固定化濃度分別為2.4，3，3 g/dL。

2.1.5 酶液添加量對固定化酯化酶相對酶活力的影響

酶液添加量對固定化酯化酶相對酶活力的影響見圖5。

圖5 酶液添加量對固定化酯化酶活力的影響Fig.5 Effect of the additive amount of enzyme solution on activity of immobilized esterase

由圖5可知，隨著固定化時間的增加，相對酶活力先增加后減小，SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG在酶液添加量為7 mL達到最大值99.65%、90.96%、92.96%；當酶添加量>7 mL時，相對酶活力呈下降趨勢；因此選擇最佳酶液添加量為7 mL。

綜合比較分析得出選擇SA-CG為最佳固定化酯化酶載體，載體比例為5∶2，載體濃度為1.8 g/dL，固定化時間為2.5 h，固化液濃度為2.4 g/dL，酶液添加量為7 mL。

2.2 固定化酯化酶響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應面試驗設計及試驗結(jié)果

響應面試驗設計及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of test

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

根據(jù)響應面試驗結(jié)果得出：固定化酯化酶相對酶活力(Y)與載體濃度(X1)、固定化時間(X2)、酶液添加量(X3)3個因素的多元線性回歸模型方程為：Y=99.04-2.77X1+0.33X2+4.16X3-2.30X1X2-1.87X1X3+1.33X2X3-8.16X12-8.83X22-10.16X32。

由表4可知，模型的P<0.0001，差異極顯著，試驗設計可靠；失擬項P=0.0564>0.05，差異不顯著，則回歸方程的擬合程度良好，可反映3個因素與響應值的關(guān)系；且模型回歸決定系數(shù)R2=0.9875，則響應值的變化有98.75%來源于所選因素的變化，該模型可用來預測酯化酶固定化條件的優(yōu)化程度?；貧w方差及各項方差結(jié)果表明，3個因素固定化酯化酶相對酶活力的影響主次順序為X3>X1>X2，即酶液添加量>載體濃度>固定化時間。另外，一次項X1和X3對Y影響極顯著(P<0.01)；交互項X1X2對Y影響顯著(P<0.05)。

由Design-Expert 8.0.6.1得出固定化酯化酶的最優(yōu)條件：載體濃度為1.68 g/dL，固定化時間為2.56 h、酶液添加量7.23 mL，其相對酶活力達到99.81%。為了便于實際操作，將最優(yōu)工藝條件修訂為：載體濃度1.68 g/dL、固定化時間153 min、酶液添加量7.23 mL。

2.2.2 固定化酯化酶條件的響應面分析及等高線

載體濃度、固定化時間、酶液添加量交互作用對固定化酯化酶相對酶活力影響的響應面曲線及等高線見圖6。

圖6 載體濃度、固化時間、酶液添加量交互作用對固定化 酯化酶相對酶活力影響的響應面曲線及等高線Fig.6 Response surface and contour map of effects of carrier concentration, immobilization time and the additive amount of enzyme solution on relative activity of immobilized esterase

由圖6可知，任何2個交互作用的響應面都存在最高點，可直觀得到各因素的最優(yōu)水平及其相互作用。

2.2.3 驗證試驗

為驗證上述結(jié)果的可靠性，在此最優(yōu)條件下做3次平行試驗，得到的固定化酯化酶的相對酶活力為(99.79±0.158)%，與預測值99.81%一致，故得到的模型能夠較好預測實際固定化酯化酶的相對酶活力，具有可靠的現(xiàn)實意義。

2.3 固定化酶操作半衰期

準確稱取一定質(zhì)量固定化酶測定初始酶活力值，并準確稱取等質(zhì)量的固定化酶顆粒加入食醋中進行催陳，做2組重復，2天后取出，計算該固定化酯化酶的操作半衰期，結(jié)果為70.7 h 。

2.4 固定化酯化酶應用于食醋的催陳作用

固定化酯化酶作用于食醋的催陳作用見圖7～圖9。

圖7 在35 ℃條件下固定化酯化酶應用于食醋的 作用時間對食醋的催陳效果Fig.7 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 35 ℃

圖8 在40 ℃條件下固定化酯化酶應用于 食醋的作用時間對食醋的催陳效果Fig.8 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 40 ℃

圖9 在45 ℃條件下固定化酯化酶應用于 食醋的作用時間對食醋的催陳效果Fig.9 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 45 ℃

由圖7～圖9可知，當固定化酯化酶添加量為9 g時，作用時間達到24 h時總酯含量都達到了最大值，在35，40，45 ℃下總酯含量分別為12.6，12.87，12.76 g/L，當時間>24 h 時總酯含量緩慢較低，可能是酯化發(fā)生了逆反應。綜合比較分析得出：在溫度為40 ℃下，固定化酯化酶添加量為9 g時，處理24 h對食醋的催陳作用效果最佳。

固定化酯化酶作用醋的前后理化指標的比較見表5，處理后食醋中氨基酸態(tài)氮含量增加，總酯含量達到12.87 g/L，相對于原醋的9.73 g/L提高了32.31%。

表5 固定化酯化酶作用醋的前后理化指標的比較Table 5 Comparison of physicochemical indexes of immobilized esterase applied to vinegar before and after treatment g/dL

3 結(jié)論

采用食品級卡拉膠與食品級海藻酸鈉復合凝膠制作的固定化酯化酶對新醋進行催陳，通過響應面法優(yōu)化得到固定化酯化酶的最優(yōu)工藝條件：固定化載體的濃度為1.68 g/dL，載體比例為5∶2，固定化時間為153 min，固化液濃度為2.4 g/dL、酶液添加量7.23 mL。在最優(yōu)工藝條件下，固定化酯化酶相對酶活力可達到99.79%；固定化酯化酶催陳食醋的條件為：酶添加量為9 g/dL，處理時間為24 h，處理溫度為40 ℃，總酯含量可達到12.87 g/L，比新醋提高了32.31%，且口感較好，醋香柔和，酯味醇厚，對改善傳統(tǒng)食醋的陳釀方法有一定的借鑒意義，對食醋企業(yè)的發(fā)展有提升經(jīng)濟效益的作用，應用前景廣闊。