螺旋藻蛋白酶解工藝的優(yōu)化及螺旋藻肽的制備

孫媛媛，鄭雪君，崔春*，李齡佳，許立鏘

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640； 2.廣東真美食品股份有限公司，廣東 潮州 521000)

螺旋藻(Spirulina)，屬藍(lán)藻綱，顫藻科，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值全面、生物活性成分豐富的低等原核生物；其蛋白含量高達(dá)60%～70%，且必需氨基酸種類齊全，組成合理，因而被認(rèn)為是人類最理想的蛋白源[1,2]。近年來(lái)，生物活性肽因具有抗氧化、延緩衰老、神經(jīng)調(diào)節(jié)等多種顯著的生物功效而受到人們廣泛研究[3]，而螺旋藻蛋白作為優(yōu)質(zhì)生物活性肽的良好來(lái)源，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景[4]。

當(dāng)前制備生物活性肽的方法主要有提取法、合成法及降解法3種，其中酶解法因反應(yīng)條件溫和、工藝簡(jiǎn)單、制備得到的活性肽穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)而成為制備生物活性肽的主流方法，因此本實(shí)驗(yàn)選用酶解法進(jìn)行螺旋藻肽酶解工藝的研究。然而，當(dāng)前螺旋藻蛋白的酶解效率普遍較低，并且螺旋藻腥味重、溶解性較差，限制了其開(kāi)發(fā)利用。為解決這一問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)選用破壁螺旋藻為原料，這將有利于螺旋藻腥味的脫除以及溶解性的提高[5]。在最優(yōu)酶解工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)制備得到的螺旋藻肽進(jìn)行了多種指標(biāo)的測(cè)定，以期為后續(xù)開(kāi)發(fā)提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

破壁螺旋藻：廣西農(nóng)墾綠仙生物保健食品有限公司；堿性蛋白酶37071：諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸鉀、甲醛等常用化學(xué)試劑：分析純，廣州市叢源儀器有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

ME204E型萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；KDN-103F微量凱式定氮儀 廣州芊薈化玻儀器有限公司；KDN-40八孔消化爐 廣州市叢源儀器有限公司；Scientz-18N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；雷磁PHS-3E pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 螺旋藻蛋白酶解工藝單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1 基本工藝

50 g破壁螺旋藻溶解于450 mL水中，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，用NaOH溶液調(diào)整pH至一定值，55 ℃水解一定時(shí)間，8000 g離心20 min，上清液即為蛋白提取液。

1.2.2 酶解pH單因素實(shí)驗(yàn)

用NaOH溶液分別調(diào)整螺旋藻溶液pH至6，7，8，9，10，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，55 ℃水解9 h后離心，得到螺旋藻蛋白酶解液。

1.2.3 酶解時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)

用NaOH溶液調(diào)整螺旋藻溶液pH至8，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，55 ℃水解6，9，12，24 h，離心后得到螺旋藻蛋白酶解液。

1.2.4 熱處理單因素實(shí)驗(yàn)

50 g破壁螺旋藻溶解于450 mL水中，分別置于70，80，90，100 ℃下進(jìn)行熱處理30 min，而后冷卻，調(diào)節(jié)pH至8，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，55 ℃水解24 h，離心后得到蛋白提取液。

1.2.5 蛋白提取液中總氮含量的測(cè)定

總氮含量由凱氏定氮法[6]測(cè)得。

1.2.6 蛋白提取液中氨氮含量的測(cè)定

α-氨基氮含量由甲醛滴定法[7]測(cè)得。

1.2.7 蛋白質(zhì)回收率的計(jì)算

1.2.8 水解度的計(jì)算

水解度(%)=上清液中α-氨基氮含量/上清液總氮含量×100。

1.3 螺旋藻肽的制備及其指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 螺旋藻肽的制備

200 g破壁螺旋藻溶解于1800 mL水中，100 ℃熱處理30 min，冷卻后調(diào)pH至8，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，55 ℃水解24 h，8000 g離心20 min，取上清液濃縮，真空冷凍干燥后即得螺旋藻肽。

1.3.2 螺旋藻肽產(chǎn)率的計(jì)算

產(chǎn)率(%)=螺旋藻肽質(zhì)量/原料質(zhì)量×100。

1.3.3 螺旋藻肽蛋白含量的測(cè)定

同1.2.5中的方法。

1.3.4 螺旋藻肽氨氮含量及水解度的計(jì)算

同1.2.6及1.2.8中的方法。

1.3.5 螺旋藻肽總糖含量的測(cè)定

依據(jù)SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》測(cè)定螺旋藻肽中總糖的含量。

1.3.6 螺旋藻肽分子量分布

高效液相色譜法測(cè)定分子量分布，色譜條件：流動(dòng)相為乙腈+水+三氟乙酸=20+80+0.1，流速0.5 mL/min，采用7.5 mm×600 mm的分析柱(TSK-Gel)進(jìn)行分析，進(jìn)樣體積為20 μL。

相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別用流動(dòng)相配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的胰島素、桿菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按一定比例混合后進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作圖得到相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線及其方程：y=-3.2389x+26.438，R2=0.9607。

1.3.7 螺旋藻肽氨基酸組成的測(cè)定

按照樣品蛋白含量準(zhǔn)確稱取樣品若干，置于水解管中，加入6 mol/L HCl 5 mL，密封。置于(110±1) ℃的烘箱中水解24 h。將水解液過(guò)濾，用水定容到50 mL容量瓶中。吸取定容后的樣品1～2 mL，置于60 ℃烘箱中脫酸。脫酸后的樣品，加入1～3 mL樣品緩沖液，震蕩均勻后用針管吸取少量，經(jīng)0.22～0.45 μm濾膜過(guò)濾后裝入試劑瓶中上機(jī)分析(日立L-8900氨基酸分析儀)。

1.3.8 螺旋藻肽中金屬元素的測(cè)定

依據(jù)GB 5009.268-2016《食品中多元素的測(cè)定》方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料總氮含量

凱氏定氮法測(cè)得破壁螺旋藻原料的總氮含量為10.75%，即蛋白質(zhì)含量為67.19%。

2.2 螺旋藻酶解工藝單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解pH單因素實(shí)驗(yàn)

pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使酶發(fā)生構(gòu)象變化從而導(dǎo)致酶活力下降，只有當(dāng)酶在合適的pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)出其催化活性。

圖1 酶解pH對(duì)蛋白回收率及水解度的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis pH on protein recovery and degree of hydrolysis

由圖1可知，酶解pH的變化對(duì)蛋白回收率及水解度均有顯著性影響，其中對(duì)于蛋白回收率的影響達(dá)到極顯著水平。隨著pH的升高，蛋白回收率先升高后降低，在pH 8時(shí)達(dá)到最高，為40.26%；水解度隨酶解pH的變化趨勢(shì)大致相同，但在pH為7，8，9時(shí)無(wú)顯著差異。綜上所述，得到酶解螺旋藻蛋白的最優(yōu)pH為8。

2.2.2 酶解時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)

圖2 酶解時(shí)間對(duì)蛋白回收率及水解度的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on protein recovery and degree of hydrolysis

由圖2可知，在酶解24 h內(nèi)，蛋白回收率及水解度都隨著時(shí)間的增加而不斷增高，在酶解24 h時(shí)回收率及水解度均達(dá)到最高，分別為45.22%和18.80%。這說(shuō)明酶解時(shí)間的增加有利于蛋白回收率的提高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用酶解24 h。

2.2.3 熱處理單因素實(shí)驗(yàn)

據(jù)報(bào)道，適當(dāng)?shù)臒崽幚砜梢蕴岣咧参锏鞍踪|(zhì)的酶解效率，這主要是由于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和聚集態(tài)發(fā)生了改變[8,9]。

圖3 熱處理對(duì)蛋白回收率及水解度的影響Fig.3 Effect of heat treatment on protein recovery and degree of hydrolysis

由圖3可知，對(duì)螺旋藻蛋白溶液進(jìn)行加熱的預(yù)處理能顯著增加蛋白回收率，相較未進(jìn)行熱處理的樣品，蛋白回收率能增加至少5%；熱處理溫度的增加有利于蛋白回收率的提高，其中在100 ℃熱處理后，蛋白回收率達(dá)到最高，為51.78%。水解度受熱處理的影響趨勢(shì)則相反，熱處理后，提取的蛋白溶液中水解度有明顯下降趨勢(shì)。

2.3 螺旋藻肽的制備及其指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 螺旋藻肽產(chǎn)率

200 g破壁螺旋藻提取得到83.02 g螺旋藻肽，產(chǎn)率為41.51%。

2.3.2 螺旋藻肽蛋白含量的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，螺旋藻肽的蛋白含量為68.30%，由此計(jì)算得到蛋白回收率為42.19%。

2.3.3 螺旋藻肽氨氮含量及水解度的計(jì)算

經(jīng)測(cè)定，螺旋藻肽的氨氮含量為2.23%，計(jì)算得到其水解度為20.42%。

2.3.4 螺旋藻肽總糖含量的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，螺旋藻肽的總糖含量為7.51%。

2.3.5 螺旋藻肽分子量分布

圖4 螺旋藻肽分子量分布液相譜圖Fig.4 Liquid-phase spectrogram of molecular weight distribution of Spirulina platensis peptides

摩爾質(zhì)量(Da)分布(%)500～100012.025100～50053.574<10034.401

由圖4和表1可知，經(jīng)最優(yōu)酶解工藝制備得到的螺旋藻肽分子量都相對(duì)較小，均低于1000 Da，其中摩爾質(zhì)量在100～500之間的肽含量占比最大，約為53.6%，說(shuō)明螺旋藻蛋白已經(jīng)得到了充分酶解，一系列小分子肽被有效制備。小分子活性肽的制備不僅有利于酶解產(chǎn)物的消化吸收[10]，而且為螺旋藻功能性肽的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2.3.6 螺旋藻肽氨基酸組成的測(cè)定

圖5 螺旋藻肽氨基酸組成液相譜圖Fig.5 Liquid-phase spectrogram of amino acid composition of Spirulina platensis peptides

氨基酸種類含量(g/100 g)氨基酸占比(%)氨基酸種類含量(g/100 g)氨基酸占比(%)Asp6.4410.75Leu5.268.79Thr3.455.77Tyr1.853.08Ser2.874.80Phe2.464.11Glu11.4719.15Lys3.696.16Gly3.215.37His0.821.36Ala5.098.51Arg2.834.73Cys0.180.30Pro2.253.75Val3.716.19必需氨基酸22.8738.20Met0.951.59非必需氨基酸37.0161.80Ile3.355.59合計(jì)59.88100

由表2可知，螺旋藻肽氨基酸種類齊全，富含賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等人體和動(dòng)物的必需氨基酸以及其他非必需氨基酸。其中谷氨酸含量最高，達(dá)到11.47%，其次是天門冬氨酸，達(dá)6.44%，其他含量較高的氨基酸還有亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸等。WHO/FAO提出，必需氨基酸量/總氨基酸量=40%，必需氨基酸量/非必需氨基酸量=0.6的參考蛋白模式可提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，在螺旋藻肽中，這2個(gè)值分別為38.2%與0.618，由此可以看出，該螺旋藻肽是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和氨基酸來(lái)源[11]。

2.3.7 螺旋藻肽中金屬元素的測(cè)定

表3 螺旋藻肽金屬元素含量分布Table 3 Content distribution of metal elements in Spirulina platensis peptides mg/kg

由表3可知，根據(jù)GB 2762-2017《食品中污染物》以及GB 19643-2016《藻類及其制品》等國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，螺旋藻肽中鉛、砷、鎘、汞、鉻等重金屬元素均未超標(biāo)，且其突出的特點(diǎn)是鎂元素含量豐富，可達(dá)到430 mg/kg。

3 結(jié)論

螺旋藻蛋白酶解的最佳工藝條件為：酶解pH 8，酶解時(shí)間24 h，熱處理100 ℃；此時(shí)，蛋白回收率達(dá)到51.78%，水解度為13.16%。

在最佳酶解工藝的基礎(chǔ)上，制備得到的螺旋藻肽蛋白含量為68.30%，蛋白回收率為42.19%，水解度為20.42%，總糖含量為7.51%。此外，分子量結(jié)果顯示：螺旋藻肽的分子量都低于1000 Da，說(shuō)明一系列小分子肽被成功制備，且氨基酸結(jié)果顯示：螺旋藻肽中含有豐富多樣的氨基酸，其中谷氨酸的含量最高。

經(jīng)檢驗(yàn)結(jié)果表明，螺旋藻肽中無(wú)重金屬元素超標(biāo)，且其中含有豐富的鎂元素，同時(shí)含有硒、銅、鐵、鈣、鋅等對(duì)人體有益的元素。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)一系列探索，得到了螺旋藻蛋白的最優(yōu)酶解工藝，從而制備了一種溶解性好的螺旋藻肽，并且通過(guò)一系列數(shù)據(jù)對(duì)螺旋藻肽的各種性質(zhì)進(jìn)行了表征，從而為螺旋藻肽的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)支撐，以期為螺旋藻功能性肽的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。