中藥對藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株體外抑菌效果試驗

葛海燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014100)

豬大腸埃希菌病是養(yǎng)豬業(yè)中常見的細(xì)菌性腸道傳染病,該病發(fā)生與流行呈上升趨勢,發(fā)病率和死亡率較高,已成為仔豬死亡的主要疾病之一,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展[1-2]。臨床上主要使用抗生素對豬大腸埃希菌病進(jìn)行治療,雖然具有一定的治療效果,但易產(chǎn)生耐藥性影響著治療效果,同時還可以導(dǎo)致畜產(chǎn)品中藥物殘留威脅著人類的健康[3-4]。中藥種類繁多且富含多種活性成分物質(zhì),具有清熱解毒、抑制細(xì)菌生長、清除內(nèi)毒素、低殘留、無毒副作用、使用安全、綠色無害等多種優(yōu)點[5]。國內(nèi)關(guān)于中藥對藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株體外抑菌試驗報道較少。因此,本試驗以四川地區(qū)臨床中分離的藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株為研究對象,采用牛津杯法和微量二倍稀釋法分別測定20味中藥對藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株體外抑菌圈直徑和MBC,篩選出對致病性大腸埃希菌敏感的藥物,確定敏感中藥聯(lián)合抑菌指數(shù),為進(jìn)一步中藥的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 臨床中分離的藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株血清型為O111,編號為SCCD201712,大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 試劑與儀器 金銀花、黃連、連翹、訶子等20種中藥,購自北京同仁堂醫(yī)藥有限公司;伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基,購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;普通營養(yǎng)培養(yǎng)基,購自蘇州嘉葉生物科技有限公司;恒溫培養(yǎng)箱由上海恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);96孔細(xì)菌培養(yǎng)板、EP管、移液槍、分析天平及分析純等常規(guī)試劑及儀器由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.3 方法

1.3.1 中藥水提物的藥液的制備 利用水提法制備的中藥藥液,將中藥在烘干箱烘干,稱量100 g,加入8倍的蒸餾水浸泡1-2 h,煮開后用慢火再煎煮0.5 h,過濾,再加入4倍蒸餾水煮沸慢煎煮0.5 h過濾藥液。濃縮為每毫升含原藥為1 g。離心后并調(diào)整其pH值為7.2～7.4之間,分裝、121℃滅菌10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試驗菌株計數(shù) 將臨床中分離的藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株SCCD201712及大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922菌種接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,挑取單菌落接種于肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)期,進(jìn)行菌落計數(shù),調(diào)整致病性大腸埃希菌地方流行株 SCCD201712及大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922菌液濃度108CFU/mL。

1.3.3 抑菌圈直徑的測定 參考文獻(xiàn)[6-7],用牛津杯法測定中藥體外抑菌圈直徑大小。判定標(biāo)準(zhǔn)為：10 mm＜抑菌圈直徑為低敏;10 mm≤抑菌圈直徑＜15 mm為中敏;15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm為高敏;20 mm≤抑菌直徑為極敏[7]。

1.3.4 中藥MBC的測定 參考文獻(xiàn)[8],用改良微量二倍法測定中藥體外的MBC。用96孔細(xì)菌培養(yǎng)板,第1～10孔加入100 μL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,在第1孔中加入100 μL中藥藥液混勻后取100 μL加入到第2孔中,以此類推到10孔,到第10孔混勻后棄去100 μL。第10孔不加藥作為陽性對照孔,第11孔不接菌做為陰性對照孔。在第1～11孔接種試驗菌株 SCCD201712各10 μL(106CFU/mL),每種藥物3個重復(fù),置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,用無菌棉簽分區(qū)劃線法培養(yǎng),無菌生長的區(qū)域則為各中藥的MBC。

1.3.5 中藥體外抑菌FICI的測定 參考文獻(xiàn)[9],采用微量肉湯棋盤稀釋法測定兩種敏感中藥的體外抑菌的聯(lián)用抑菌指數(shù)(FICI),根據(jù)體外抑菌試驗結(jié)果,選擇兩種抑菌效果穩(wěn)定的中藥作為主藥分別與其他的敏感藥物組合,并測定聯(lián)用抑菌指數(shù)(FICI);參考文獻(xiàn)[10],判定兩種藥物的FICI,判定的標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)FICI≤0.5時為顯著協(xié)同作用,當(dāng)0.5＜FICI＜1.0時為協(xié)同作用,當(dāng)FICI=1.0時為相加作用,1.0＜FICI＜2.0時,為無關(guān)作用,當(dāng) FICI≥2.0時為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 中藥抑菌圈直徑檢測結(jié)果 由表1可知,藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株SCCD201712對黃連、訶子、白頭翁、五味子、五倍子5種藥物高度敏感,其抑菌圈直徑在16.3 mm～19.8 mm之間;對黃柏、黃芩、板藍(lán)根、金銀花、秦皮、穿心蓮、大黃7種藥物中度敏感,其抑菌圈直徑在13.3 mm～14.6 mm之間;對連翹、沙棘、苦參、魚腥草4種藥物低度敏感,其抑菌圈直徑在8.2 mm～6.6 mm之間;大青葉、紫花地丁、蒲公英、夏枯草4種藥物無效果。

表1 中藥對藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株體外抑菌圈直徑測定結(jié)果

2.2 中藥體外MBC檢測結(jié)果 由表2可知,藏香豬 源致病性大腸埃希菌地方流行株SCCD201712對黃連、訶子、白頭翁、五味子、五倍子5種藥物MBC最小,其MBC在15.65～31.25 mg/mL之間;對黃柏、黃芩、板藍(lán)根、金銀花、秦皮、穿心蓮、大黃7種藥物的MBC在62.5～125 mg/mL之間;對連翹、沙棘、苦參、魚腥草4種藥物的 MBC在 250～500 mg/mL之間;大青葉、紫花地丁、蒲公英、夏枯草4種藥物無效果。

表2 中藥對藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株體外MBC測定結(jié)果

2.3 中藥體外FICI的測定結(jié)果 根據(jù)20種中藥體外抑菌試驗結(jié)果,選擇體外抑菌效果較好的訶子、五味子作為主藥分別于與黃連、白頭翁、五倍子3種藥物組合,測定其FICI。由表3可知,訶子+黃連、訶子+白頭翁2種中藥組合具有協(xié)同作用;訶子+五倍子、五味子+黃連、五味子+白頭翁3種中藥組合具有相加作用;因而說明了4種中藥組合可以提高抑菌效果,五味子+五倍子組合有拮抗作用,影響其抑菌效果。

表3 中藥對藏香豬源致病性大腸埃希_菌地方流行株體外FICI的測定結(jié)果

3 討論

豬大腸埃希菌病為常見的細(xì)菌傳染性疾病之一,該病可以引起不同日齡的豬發(fā)病,尤其是對仔豬易感,發(fā)病率和死亡率都較高,給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟損失,影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[11]。大腸埃希菌可以引起多種動物發(fā)病,為主要人獸共患病病原菌,該菌血清型眾多復(fù)雜,具有地域流行性,沒有理想疫苗進(jìn)行預(yù)防,造成大腸埃希菌病發(fā)生與流行,該病可以在多種動物與人之間相互傳播,因此,抗生素是防治大腸埃希菌病的主要手段[12]。在養(yǎng)豬過程中,為了更好地預(yù)防相關(guān)疾病,在藏香豬養(yǎng)殖過程中大量的使用抗生素,致使相關(guān)的細(xì)菌性疾病產(chǎn)生了很強的耐藥性,尤其大腸埃希菌產(chǎn)生的耐藥性較強,同時也造成畜產(chǎn)品中嚴(yán)重的藥殘,這些畜產(chǎn)品中的藥物殘留可以通過多種食物轉(zhuǎn)移到人們的身上,并且嚴(yán)重威脅人們的健康[2]。相關(guān)研究表明,中藥可以直接殺滅病原菌或通過多種途徑間接提高機體免疫力達(dá)到防治疾病的效果[13]。本試驗以內(nèi)蒙古地區(qū)臨床中分離的藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株為研究對象,通過牛津杯法和微量二倍稀釋法分別測定20味中藥對藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株體外抑菌效果,篩選出黃連、訶子、白頭翁、五味子、五倍子5種敏感的藥物。與張賽奇等[4]、張召興等[7]、張召興等[8]等報道存在一定差異性,可能與大腸埃希菌的流行的血清型、感染的宿主和地域有關(guān)。本試驗通過測定敏感藥物體外聯(lián)合抑菌指數(shù)FICI,結(jié)果表明,訶子+黃連、訶子+白頭翁2種中藥組合具有協(xié)同作用,訶子+五倍子、五味子+黃連、五味子+白頭翁3種中藥組合具有相加作用,因而證實了這幾種中藥可以組合在一起,提高其抑菌效果。五味子+五倍子組合有拮抗作用,影響其抑菌效果。通過測定敏感藥物體外聯(lián)合抑菌指數(shù)FICI,確定了敏感中藥之間組合及抑菌效果,為進(jìn)一步研發(fā)防治藏香豬源致病性大腸埃希菌病復(fù)方中藥制劑提供參考依據(jù)。中藥組合根據(jù)藥物藥理作用確定的,不同的中藥由于藥理性質(zhì)的不同,對其抑菌效果也存在一定的差異性,在中藥組合時,應(yīng)引起重視。由于中藥中富含多種化學(xué)成分,抑菌機理尚未明確,有待進(jìn)一步研究。本試驗四川地區(qū)藏香豬源致病性大腸埃希菌病防治提供研究基礎(chǔ)。