蒙藥“訶子解草烏毒”的配伍比例研究Δ

劉爽，張曉菲，苗鑫，邢海燕，李剛#（1.內蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，呼和浩特010110；.內蒙古醫(yī)科大學藥學院，呼和浩特 010110）

草烏和訶子均為蒙醫(yī)藥學中的常用藥材。其中，草烏為毛茛科植物北烏頭（Aconitum kusnezoffiiReichb.）的干燥塊根，具有治療關節(jié)炎、強心和止痛等功效[1]。據統計，在蒙醫(yī)治療“粘”病和“協日烏素”病的方劑中，有草烏入藥的方劑分別占45%和57%，是蒙醫(yī)臨床不可缺少的一味藥[2]。然而，草烏有大毒，且以心臟毒性最強，因此在蒙醫(yī)學中，草烏多在炮制后或配伍后入藥，其中以訶子制草烏或配伍草烏使用較為常見[3]。訶子蒙醫(yī)稱“阿如拉”，為使君子科植物訶子（Terminalia chebulaRetz.）的干燥成熟果實，不僅無毒副作用，而且還有解毒功效，臨床應用甚廣，素有“蒙藥之王”之稱[4]。19世紀的《蒙藥正典》指出[5]：“含有草烏的方劑中必須搭配訶子”。因此，草烏與訶子的配伍比例是使用過程中需要關注的問題。在蒙醫(yī)臨床中，生草烏與訶子的常用配伍比例是1∶1和3∶1[6]。然而，不同比例訶子對草烏心臟毒性的解毒作用是否有差異，以及增大訶子用量之后其解毒效果是否會增強，還未可知。故本研究首先展開加入不同比例訶子后對生草烏致心臟毒性的解毒效果比較。

烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿3種雙酯型生物堿是草烏中的主要有效成分，也是其主要的毒性成分[7]，具有增加心臟心率、改善心肌收縮等強心作用，但同時也具有引起心率失常等毒性作用[8]。另外，李建良等[9]通過網絡藥理學驗證了訶子中大量的鞣質（單寧酸）可以緩解雙酯型烏頭堿的毒性作用。因此，本研究進一步選取草烏中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿這3種烏頭堿以及訶子中的單寧酸作為體外研究對象，并從藥動學的主要參數之一血漿蛋白結合率著手，研究訶子解草烏致心臟毒性的可能機制。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate3000超高效液相色譜（UPLC）儀、Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（MS）系統（美國Thermo-Fisher公司）；HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；UPHW-II-90T超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；DM IL LED熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

訶子（批號：20140121）、生草烏（批號：20140101）均購于呼和浩特市藥材市場，分別經內蒙古醫(yī)科大學藥學院渠弼教授、王小琴教授鑒定為使君子科植物訶子的干燥果實和毛茛科植物北烏頭的干燥塊根；肌鈣蛋白（cTn-I）試劑盒（批號：H149-2）、肌紅蛋白（MB）試劑盒（批號：H150）均購自南京建成生物工程研究所；烏頭堿標準品（批號：110797-201108，純度：98%）、新烏頭堿標準品（批號：110799-201107，純度：98%）、次烏頭堿標準品（批號：110798-201307，純度：98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；單寧酸標準品（北京盛世康普化工技術研究院，批號：160509，純度：98%）；健康人血漿（購自內蒙古人民醫(yī)院）；利血平標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號：XA0813YB14，純度：98%）；乙腈（美國Fisher公司，批號：A998-4，色譜純）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）粉末（北京酷來博科技有限公司，批號：PM5090-10）；其余試劑均為分析純試劑。

1.3 動物

SD大鼠40只，♂，潔凈級，體質量（200±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產質量合格證號：SCXK（京）2016-0002。購入后，將大鼠飼養(yǎng)于內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心，控制室溫為（20±2）℃、相對濕度為72%，12 h晝夜交替。飼養(yǎng)期間自由采食、飲水。

2 方法

2.1 生草烏-訶子不同比例配伍對生草烏致大鼠心臟毒性的解毒作用

2.1.1 藥液的制備

（1）生草烏混懸液的制備：精密稱定生草烏粉末1.2 g，加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液100 mL，攪拌均勻后，制成質量濃度為0.012 g/mL的生草烏混懸液，置于4℃冰箱中保存，待用。（2）生草烏-訶子不同比例配伍的混懸液的制備：分別精密稱定生草烏粉末1.2 g，按生草烏-訶子（1∶3、1∶1、3∶1）的質量比例，加入不同質量的訶子混合，加入0.5%CMC-Na溶液100 mL，攪拌均勻后，制備成相應質量濃度生草烏-訶子的混懸液，置于4℃冰箱中保存，待用。

2.1.2 大鼠分組與給藥

將40只大鼠隨機分為空白對照組、生草烏組和生草烏-訶子（1∶3、1∶1、3∶1）組[10]，每組8只。據文獻報道[11]，大鼠出現中毒癥狀的生草烏給藥劑量為0.12 g/kg，所以在本研究中以生草烏劑量為0.12 g/kg計算給藥量，即生草烏組大鼠的給藥劑量為生草烏0.12 g/kg，生草烏-訶子（1∶3）組大鼠的給藥劑量為0.12 g/kg生草烏+0.36 g/kg訶子，生草烏-訶子（1∶1）組大鼠的給藥劑量為0.12 g/kg生草烏+0.12 g/kg訶子，生草烏-訶子（3∶1）組大鼠的給藥劑量為0.12 g/kg生草烏+0.04 g/kg訶子，而空白對照組大鼠給予等體積的0.5%CMC-Na溶液。各組大鼠均每天灌胃給藥1次，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)給藥28 d。

2.1.3 血清生化指標的檢測

大鼠在末次給藥30 min后，乙醚麻醉，腹主動脈取血，血液先在冰浴中靜置2 h，然后在4℃條件下以3 000 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒說明書操作測定大鼠血清中cTn-I、MB含量。

2.1.4 心臟病理切片觀察

大鼠麻醉后，腹主動脈取血，處死，迅速取心臟組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（5 μm），經蘇木精-伊紅（HE）染色后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察各組大鼠心臟組織的病理學變化。

2.2 平衡透析法聯合液質聯用技術測定草烏中3種烏頭堿的血漿蛋白結合率及訶子中單寧酸對其血漿蛋白結合率的影響

2.2.1 溶液的制備

（1）透析液：透析內液為人血漿，透析外液為PBS（取一袋PBS粉末，用去離子水溶解，定容至1 L，調節(jié)pH至7.2，即得PBS）。（2）標準品溶液：分別精密稱取1.0 mg的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿和單寧酸標準品，各自溶于1 mL的PBS中，得到質量濃度均為1.0 mg/mL的4種物質的單一標準品溶液。（3）內標溶液：精密稱取1.0 mg利血平標準品，溶于5 mL甲醇溶液中，得到質量濃度為200.0μg/mL的利血平內標溶液。

2.2.2 液質聯用的檢測條件

色譜條件：色譜柱為C18（型號：25002-1，美國Thermo公司）；流動相為0.1%甲酸水-乙腈（65∶35，V/V）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；進樣體積為3μL。質譜條件：采用電噴霧離子源下的正離子掃描模式，離子化源溫度為300℃；毛細管電壓為3.5 kV；離子通道水平為50；離子傳輸管溫度為300℃；鞘氣壓力為40 arb；輔助氣壓壓力為2 arb；掃描模式為一級陽離子全掃模模式，用于定量的離子為質荷比為[M+H]+646.322（烏頭堿）、[M+H]+616.311（次烏頭堿）、[M+H]+632.307（新烏頭堿）。

2.2.3 方法學考察

（1）專屬性。精密吸取透析內、外液各300μL，分別加入一定量的3種烏頭堿標準品溶液，按“2.2.4”項下方法處理樣本后，按“2.2.2”項下條件進樣測定。

（2）標準曲線的制備及定量下限。在透析內、外液中分別加入3種烏頭堿的標準品溶液，制備其終質量濃度均分別為 3.75、7.5、22.5、37.5、75、150、375 ng/mL的樣品溶液，按“2.2.4”項下方法處理樣本后，按“2.2.2”項下條件進樣測定，以樣品質量濃度為橫坐標（x）、樣品峰面積與內標峰面積之比為縱坐標（y），通過線性回歸分析得到標準曲線方程，并以信噪比（S/N）＝10計算定量下限。

（3）穩(wěn)定性和精密度。精密吸取透析內、外液各300μL，分別加入一定量的3種烏頭堿標準品溶液，使其在透析內、外溶液中的終質量濃度分別為2、18、280 ng/mL，每個質量濃度平行制備3份樣品，按“2.2.4”項下方法處理后，按“2.2.2”項下條件進樣測定，檢測配制當日和連續(xù)3日的樣品濃度，考察日內和日間精密度；以及將同一批樣品室溫放置1、6、24 h和－20℃反復凍融3次后測定樣品的濃度，考察3種烏頭堿在室溫下放置24 h和在－20℃條件下凍融3次的穩(wěn)定性。

（4）回收率。精密吸取透析內、外液各300μL，加入一定量的3種烏頭堿標準品溶液，使其在透析內、外液中的終質量濃度均為2、18、280 ng/mL，每個樣本平行制備3份，按“2.2.4”項下方法處理后，按“2.2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積并計算方法回收率。

2.2.4 透析液的樣本處理

透析結束后，吸取透析外液，加入等量3%三氯乙酸溶液觀察是否有血漿蛋白滲漏情況。若無滲漏情況，則分別吸取透析內液樣本和透析外液樣本各300μL，置于1.5 mL離心管中，加入3倍量的乙腈沉淀蛋白，加入內標溶液（使樣品溶液中利血平的終質量濃度為0.25μg/mL），然后在4℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣檢測。

2.2.5 草烏中3種烏頭堿與健康人血漿的血漿蛋白結合率的測定

首先，將透析袋剪成15～20 cm的小段，在煮沸的蒸餾水中煮沸10 min，冷卻后，去離子水徹底清洗透析袋內、外側各3遍，洗凈后將其完全浸沒在蒸餾水中，待用。用絲線扎住處理好的透析袋的一端，輕輕除去袋中的水，將空白人血漿（透析內液）2 mL加入透析袋中，并將透析袋的另一端固定。然后將透析袋懸浮于分別含3種烏頭堿質量濃度為5、10、20、40、80、160、400 ng/mL的40 mL透析外液（PBS）中，密封瓶口，于37℃水浴鍋中平衡透析24 h，按“2.2.4”項下方法處理樣本后，按“2.2.2”項下條件進樣檢測，并計算3種烏頭堿的血漿蛋白結合率：血漿蛋白結合率（%）＝（c內－c外）/c內×100%，其中c內為測得的透析內液中烏頭堿的質量濃度，c外為測得的透析外液中烏頭堿的質量濃度。試驗重復3次。

2.2.6 訶子中單寧酸對草烏中3種烏頭堿血漿蛋白結合率的影響

取處理好的透析袋，按“2.2.5”項下方法操作并測定單寧酸對草烏中3種烏頭堿血漿蛋白結合率的影響，40 mL透析外液中3種烏頭堿與單寧酸的比例分別為1∶0.5、1∶0.1、1∶0.075和1∶0.025（固定3種烏頭堿的質量濃度均為100 μg/mL），并以不加單寧酸為空白對照。試驗重復3次。

2.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。所有數據均以x±s表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 生草烏-訶子不同比例配伍對生草烏致大鼠心臟毒性的解毒作用考察結果

3.1.1 血清中cTn-I、MB的含量變化

與空白對照組比較，生草烏組和生草烏-訶子（1∶3）組大鼠血清cTn-I、MB含量顯著增加（P＜0.05）。與生草烏組比較，生草烏-訶子（1∶3、1∶1、3∶1）組大鼠血清中cTn-I、MB含量均顯著降低（P＜0.05），并且生草烏-訶子（1∶1、3∶1）組大鼠血清中cTn-I、MB含量較空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠血清中cTn-I、MB含量測定結果見表1。

表1 各組大鼠血清中cTn-I、MB含量測定結果（x±s，n＝8，ng/L）Tab 1 Determination results of serum contents of cTn-I and MB of rats in each group（x±s，n＝8，ng/L）

3.1.2 心臟病理切片觀察結果

HE染色結果顯示，空白對照組大鼠心肌組織細胞排列整齊，界限清楚，形態(tài)正常，胞核明顯，未見心肌纖維破壞。與空白對照組比較，生草烏組大鼠心肌組織病理結構明顯改變，心肌細胞排列紊亂，細胞固縮，胞漿淡染，部分細胞變形壞死。生草烏-訶子（3∶1）組大鼠心肌細胞病理結構與生草烏組比較有明顯改善，與空白對照組相近，細胞排列整齊，形態(tài)正常；生草烏-訶子（1∶1）組和生草烏-訶子（1∶3）組大鼠心肌組織病理結構與生草烏組相比有所改善，可見部分細胞排列整齊，界限清晰，但與空白對照組比較則還是有一定的損傷，并不能完全恢復正常。各組大鼠心臟病理切片圖見圖1。

圖1 各組大鼠心臟病理切片圖（×200）Fig 1 Pathological section observation of cardiac tissue in each group（×200）

3.2 草烏中3種烏頭堿與人血漿的血漿蛋白結合率測定結果

3.2.1 方法學考察結果

（1）專屬性。結果顯示，在透析內、外液中，烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿的保留時間均分別為4.23、3.17、4.18 min，各成分分離良好，未見有雜質峰干擾，提示分析方法可行，色譜圖見圖2。

（2）標準曲線的制備及定量下限。結果顯示，在透析內、外液中，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在測定質量濃度范圍內與其峰面積線性關系良好，定量下限均為0.375 ng/mL，結果見表2。

（3）穩(wěn)定性和精密度。結果顯示，在透析內、外液中，3種烏頭堿的日內、日間精密度的RSD均小于10%（n＝3），符合生物樣本含量測定要求；在室溫放置1、6、24 h后，3種烏頭堿含量的RSD均＜10%（n＝3），說明樣品在24 h內穩(wěn)定性良好；但在反復凍融3次后，3種烏頭堿含量的RSD均＞12%（n＝3），說明樣品的凍融穩(wěn)定性較差。

（4）回收率。結果表明，3種烏頭堿在透析內、外液中的平均方法回收率均在80%～100%之間，RSD均小于10%（n＝3），表明該方法的準確度較好，結果見表3。

3.2.2 血漿蛋白結合率測定結果

圖2 質子流色譜圖Fig 2 Proton flow chromatograms

表2 透析內、外液中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的標準曲線回歸方程及定量下限測定結果Tab 2 Standard curve regression equation and lower quantitation limit of aconitine，mesaconitine and hypaconitine in dialysis tubing inside and outside

3種烏頭堿與正常人血漿的血漿蛋白結合率均不高，在27%～35%之間，無明顯的濃度依賴性，且同一烏頭堿不同質量濃度間的血漿蛋白結合率差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表4。

3.2.3 訶子中單寧酸對草烏中3種烏頭堿與正常人血漿的血漿蛋白結合率的影響結果

與不加單寧酸的空白對照比較，當3種烏頭堿分別與單寧酸以1∶0.5、1∶0.1和1∶0.075的比例配伍時，3種烏頭堿與正常人血漿的血漿蛋白結合率均顯著降低（P＜0.05）；當烏頭堿、次烏頭堿與單寧酸的配伍比例達到1∶0.025時，3種烏頭堿與正常人血漿的血漿蛋白結合率降低不明顯（P＞0.05），結果見表5。

表3 不同質量濃度烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿在透析內、外液中的回收率測定結果（x±s，n＝3）Tab 3 Recovery rates of different concentrations of aconitine，mesaconitine and hypaconitine in dialysis tubing inside and outside（x±s，n＝3）

表4 不同質量濃度烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿與正常人血漿的血漿蛋白結合率測定結果（x±s，n＝3，%%）Tab 4 Plasma protein binding rate of different concentrations of aconitine，mesaconitine and hypaconitine with normal human plasma（x±s，n＝3，%%）

表5 單寧酸對烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿與正常人血的血漿蛋白結合率的影響（x±s，n＝3）Tab 5 Effects of tannic acid on plasma protein binding rate of aconitine，mesaconitine and hypaconitine with normal human blasma（x ± s，n＝3）

4 討論

烏頭堿類藥物中毒后主要引起惡心、心率失常及組織缺氧，而缺氧組織灌溉不足會引發(fā)多臟器功能衰竭[12]，其中的心臟毒性作用是主要致死原因，并且無特效解毒藥，在蒙醫(yī)學中草烏常用于外用，內服多與訶子配伍使用達到“解毒存效”的作用[13-14]。血清cTn-I屬于心肌重要的結構蛋白，是一種復合物，可作為心肌損傷的血清學標志物之一[15]。另有研究發(fā)現，血清中MB對于心肌梗死診斷的靈敏度較高[16]。因此，本研究選用cTn-I和MB這2個常見的心肌損害標志物來評價實驗動物的心肌損傷情況。本研究結果顯示，生草烏有明顯的心臟毒性，其可顯著提高大鼠血清中cTn-I、MB含量，并且對大鼠的心臟組織有明顯損傷，出現胞漿淡染，部分細胞變形壞死等情況，這與之前的報道一致[17-18]。而訶子表現出明顯的解毒效果，其中以生草烏-訶子（3∶1、1∶1）組解毒效果為好。

測定藥物血漿蛋白結合率的方法有超濾法、平衡透析法和微透析法等。其中平衡透析法和超濾法較為常用[19]。目前，尚未見平衡透析法測定3種烏頭堿的血漿蛋白結合率及單寧酸對其血漿蛋白結合率影響的相關文獻報道。本研究通過預試驗最后確定了24 h的平衡透析時間和37℃的透析溫度，設置3種烏頭堿質量濃度均為5、10、20、40、80、160、400 ng/mL，采用平衡透析法測定人血漿中3種烏頭堿的蛋白結合率。研究結果表明，3種烏頭堿與人血漿蛋白結合強度低，即在人體內的游離藥物濃度均較高。這提示，3種烏頭堿毒副作用較大，治療窗較窄，血漿中3種烏頭堿的游離藥物的較小波動即會引起藥效和毒副作用的變化。

在血漿蛋白結合率的測定試驗中，單寧酸與3種烏頭堿的配伍比例是依據草烏-訶子不同比例配伍中生藥含量，與生藥中各成分的含量換算成3種烏頭堿與單寧酸的比例來設置的，其中3種烏頭堿與單寧酸的配伍比例為1∶0.025是低于生草烏-訶子（3∶1）的配伍比例，1∶0.075、1∶0.1的配伍比例則相當于生草烏-訶子（3∶1和1∶1）的配伍比例，1∶0.5的配伍比例則接近與生草烏-訶子（1∶3）的配伍比例（嚴格換算是1∶0.065）。本研究結果表明，當3種烏頭堿與單寧酸的配伍比例為1∶0.025時，3種烏頭堿的血漿蛋白結合率與空白對照比較沒有明顯變化；當比例為1∶0.1和1∶0.075時，3種烏頭堿的血漿蛋白結合率降低（P＜0.05）；而當比例達到1∶0.5時，3種烏頭堿的血漿蛋白結合率進一步降低（P＜0.05），約為空白對照血漿蛋白結合率的30%，游離藥物濃度進一步升高，在藥效增加的同時毒副作用也隨之增強。這也初步解釋了前述動物實驗中出現的生草烏-訶子（1∶3）組的解毒效果沒有生草烏-訶子（3∶1）組的效果好。

綜上所述，本研究結果證實了生草烏-訶子以3∶1的比例配伍對草烏致大鼠心臟毒性的解毒效果最好，其次是生草烏-訶子以1∶1配伍，而訶子量最大的組即生草烏-訶子按1∶3配伍后的解毒效果不及前兩者好。結合血漿蛋白結合率的結果來看，原因可能是訶子可以降低草烏的血漿蛋白結合率，隨著訶子用量的增加，草烏中3種烏頭堿的血漿蛋白結合率降低，使游離藥物濃度超過安全血藥濃度從而產生了毒副作用?？芍轂?訶子在本研究中解毒作用最佳配伍比例為3∶1，該結果為“訶子解草烏毒”臨床應用提供了一定的實驗依據。