Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化芡實(shí)中總維生素E的提取工藝研究Δ

王紅，吳啟南，崔永偉，伍城穎，沈蓓，樊修和（.南京市溧水區(qū)中醫(yī)院藥劑科，南京00；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 003）

芡實(shí)為睡蓮科芡屬一年水生草本植物芡（Euryale feroxSalisb.）的干燥成熟種仁，具有養(yǎng)血安神、益腎固精、補(bǔ)脾止瀉、祛濕止帶的功效[1-2]。在2007年，李美紅等[3]從芡實(shí)中分離純化了不同構(gòu)型的生育酚（α、β、γ、δ-生育酚）類物質(zhì)。生育酚又名維生素E，其中α-生育酚是自然界分布最為廣泛、含量最多且活性最高的維生素E的存在形式[4]，作為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑[5]，其在促進(jìn)性激素分泌、增強(qiáng)免疫功能、對抗自由基氧化等過程中扮演著重要的角色，同時也是芡實(shí)中醫(yī)功效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[6-7]。Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，已被廣泛地用于多因素的試驗(yàn)優(yōu)化[8-11]。本文使用超聲輔助法，以無水乙醇為提取劑，采用高效液相色譜法測定芡實(shí)中總維生素E的含量[12]，通過單因素試驗(yàn)考察提取時間、提取次數(shù)、超聲功率、粉碎度對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響，再利用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝條件，為后續(xù)芡實(shí)脂溶性成分的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供試驗(yàn)依據(jù)，也為芡實(shí)中總維生素E的資源開發(fā)與利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，配有高精度四元梯度泵、三極管陣列檢測器（PDA）、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；KH300SP超聲波提取設(shè)備（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琪有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；BT125千分之一電子天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SAGA-10TY實(shí)驗(yàn)室級超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芡實(shí)藥材采自揚(yáng)州高郵湖，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為真品；α-生育酚（批號：120961，純度：99%）、β-生育酚（批號：120894，純度：99%）、δ-生育酚（批號：121052，純度：99%）對照品均購自美國Sigma公司；抗壞血酸粉末（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：F20100108，試驗(yàn)中防止維生素E氧化）；甲醇為色譜純，無水乙醇為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 芡實(shí)中總維生素E的提取

參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[10]，取干燥的芡實(shí)藥材，打粉過80目篩；稱取一定量的芡實(shí)粉末，置于錐形瓶中，依次加入無水乙醇、抗壞血酸溶液（質(zhì)量濃度為0.05 g/mL），超聲（頻率：40 kHz，功率：240 W）提取，過濾，濾液轉(zhuǎn)入球形蒸發(fā)瓶，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收溶劑，得總維生素E干浸膏。

2.2 芡實(shí)中總維生素E的含量測定

總維生素E量以α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的總和計(jì)。

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水溶液（97∶3，V/V）；檢測波長為295 nm；柱溫為30℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液的制備：分別精密稱取12、5.6、0.96 mg的α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚對照品，至10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚質(zhì)量濃度分別為1.2、0.56、0.096 mg/mL的混合對照品溶液。（2）供試品溶液的制備：取“2.1”項(xiàng)下制備的干浸膏適量，用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 專屬性考察 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，α-生育酚與β-生育酚、β-生育酚與δ-生育酚的分離度均＞1.5，以α-生育酚峰計(jì)理論板數(shù)均＞2 000。色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關(guān)系、檢測限及定量限考察 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液0、100、200、500、800 μL至1 mL量瓶中，甲醇定容，取10 μL按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的線性回歸方程及線性范圍。另取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1時得檢測限，當(dāng)信噪比為10∶1時得定量限。α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的回歸方程、線性范圍、檢測限及定量限見表1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的回歸方程、線性范圍、檢測限及定量限Tab 1 Regression equation，linear range，detection limit and quantification limit of α-tocopherol，β-tocopherol and δ-tocopherol

2.2.5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn) 將α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚對照品按相關(guān)方法進(jìn)行操作。結(jié)果，在精密度試驗(yàn)中，α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面積的RSD分別為1.53%、1.88%、2.06%（n＝6），表明該方法精密度良好；在重復(fù)性試驗(yàn)中，α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面積的RSD分別為2.05%、1.64%、2.18%（n＝6），表明該方法的重復(fù)性良好；在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，24 h內(nèi)α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面積的RSD分別為1.36%、2.42%、1.73%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；加樣回收率試驗(yàn)中，α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的平均加樣回收率分別為98.23%、101.75%、104.32%，RSD分別為1.62%、2.41%、1.55%（n＝9）。

2.3 單因素試驗(yàn)篩選芡實(shí)中總維生素E提取工藝

在對芡實(shí)中總維生素E的提取過程中，藥材的提取時間、提取次數(shù)、超聲功率、粉碎度等因素對提取率有著重要的影響[13-17]。因此在本試驗(yàn)中，選擇上述因素進(jìn)行考察。

2.3.1 提取時間 稱取60目芡實(shí)粉末6份，每份2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，依次加入60 mL無水乙醇，10 mL抗壞血酸，在超聲功率為240 W的條件下提取1次，考察不同提取時間（10、20、30、60、120、180 min）對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響。結(jié)果，隨著提取時間的增加，芡實(shí)中總維生素E提取量先呈上升趨勢，當(dāng)提取時間為60 min時，總維生素E提取量最高（1.644 mg/g），再增加提取時間總維生素E提取量呈下降趨勢，由此確定芡實(shí)中總維生素E超聲提取時間為60 min，詳見圖2A。

圖2 各因素對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響Fig 2 Effects of each factor on the extraction amount of total vitamin E in E.ferox

2.3.2 提取次數(shù) 稱取60目芡實(shí)粉末6份，每份2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，依次加入60 mL無水乙醇，10 mL抗壞血酸，提取時間為60 min，超聲功率為240 W的條件下分別提取1、2、3、4、5、6次，考察不同提取次數(shù)對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響。結(jié)果，隨著超聲提取次數(shù)的增加，芡實(shí)中總維生素E提取量先呈上升趨勢，當(dāng)提取次數(shù)為3次時，總維生素E提取量最高（1.754 mg/g），再增加提取次數(shù)總維生素E提取量呈下降趨勢，由此確定芡實(shí)中總維生素E超聲提取次數(shù)為3次，詳見圖2B。

2.3.3 超聲功率 稱取60目芡實(shí)粉末6份，每份2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，依次加入60 mL無水乙醇，10 mL抗壞血酸，提取時間為60 min，分別以超聲功率150、180、210、240、270、300 W提取1次，考察不同超聲功率對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響。結(jié)果，隨著超聲功率的增加，芡實(shí)中總維生素E提取量先呈上升趨勢，當(dāng)超聲功率達(dá)到240 W時，總維生素E提取量最高（1.786 mg/g），再提高超聲功率總維生素E提取量呈下降趨勢，由此確定芡實(shí)中總維生素E超聲的功率為240 W，詳見圖2C。

2.3.4 粉碎度 稱取芡實(shí)過篩20、40、60、80、100、120目粉末各1份，每份2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，依次加入60 mL無水乙醇，10 mL抗壞血酸，超聲功率為240 W，提取時間為60 min，考察不同粉碎度對對芡實(shí)中總維生素E提取量影響。結(jié)果，隨著粉碎度的增加，芡實(shí)中總維生素E提取量呈上升趨勢，當(dāng)粉碎度達(dá)到80目，總維生素E提取量最高（1.742 mg/g），再提高粉碎度，總維生素E提取量呈下降趨勢，由此確定芡實(shí)中總維生素E的粉碎度為80目，詳見圖2D。

2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化芡實(shí)中總維生素E的提取工藝

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以提取時間（X1）、提取次數(shù)（X2）、超聲功率（X3）、粉碎度（X4）為自變量（Xi），總維生素E提取量（Y）作為響應(yīng)值，采用中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，在4因素3水平的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化芡實(shí)總維生素E的最佳提取工藝，因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3 Design and results of tests

2.4.2 模型建立與方差分析 采用Design-Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)并分析處理相關(guān)數(shù)據(jù)，得到二次多項(xiàng)回歸方程Y＝2.04+0.12X1+0.34X2+0.10X3+0.088X4+0.073X1X2－0.099X1X3－0.023X1X4－0.13X2X3－0.049X2X4－0.091X3X4－0.49X12－0.30X22－0.40X32－0.49X42（R2＝0.952 5）。方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，該模型的P＜0.000 1，表明虛擬模型顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提取次數(shù)、提取時間、超聲功率對芡實(shí)總維生素E提取量的影響顯著，各因素的二次項(xiàng)系數(shù)也均對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響顯著；交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4對芡實(shí)中總維生素E含量的影響不顯著，各因素對芡實(shí)中總維生素E提取量影響的大小順序依次為X2＞X1＞X3＞X4。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

2.4.3 響應(yīng)面分析 利用Design-Expert V 8.0.6軟件分析，得出影響芡實(shí)中總維生素E提取量的各因素交互作用的相應(yīng)響應(yīng)面圖，各因素對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響見圖3。

由圖3可知，提取時間與超聲功率之間、提取時間與粉碎度之間、超聲功率與粉碎度之間的交互作用增強(qiáng)，但還未達(dá)到顯著水平，而提取次數(shù)與提取時間之間、提取次數(shù)與超聲功率之間、提取次數(shù)與粉碎度之間的交互作用不顯著，總維生素E的提取量隨著提取時間、超聲功率、粉碎度三者之間的交互作用呈現(xiàn)由低到高再到低的趨勢。因此，在適合的提取時間、超聲功率、粉碎度下，總維生素E的提取量會出現(xiàn)極大值，且應(yīng)位于響應(yīng)面的頂部。由Design-Expert V 8.0.6軟件分析得出：在穩(wěn)定狀態(tài)下芡實(shí)中總維生素E提取量的最大值為2.153 mg/g，相對應(yīng)的提取時間為80.49 min、提取次數(shù)為3.54次、超聲功率為242.69 W、粉碎度為80.44目。以實(shí)際操作的方便考慮，將其修正為提取時間80 min、提取次數(shù)3次、超聲功率240 W、粉碎度80目。

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化提取工藝，分別取芡實(shí)藥材2、20、40 g進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果，總維生素E的提取量分別為2.063、2.103、2.085 mg/g（RSD分別為2.6%、1.5%、1.3%，n＝3），與預(yù)測值2.092 mg/g的相對誤差分別為0.14%、0.53%、0.33%，提示3次驗(yàn)證試驗(yàn)的總維生素E提取量差異較小，說明該工藝穩(wěn)定可靠。

圖3 各因素與芡實(shí)中總維生素E提取量之間的響應(yīng)面圖Fig 3 Response surface plots for each factors on the extraction amount of total vitamin E in E.ferox

3 討論

中藥芡實(shí)的化學(xué)成分多樣，但由于其含有大量淀粉，加大了分離芡實(shí)藥效成分的難度。為了優(yōu)化芡實(shí)總維生素E的提取工藝，筆者通過預(yù)試驗(yàn)，先后考察了提取方法、提取溶劑的種類、提取次數(shù)、提取時間、超聲功率、粉碎度等對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響。在提取方法方面，筆者比較了回流法、超聲法與索氏提取法，結(jié)果超聲法提取效果最好，操作簡單；隨后，又考察了以石油醚、無水乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、甲醛等為溶劑對提取量的影響，結(jié)果以無水乙醇為溶劑提取效果最好。綜合考慮，提取時間、提取次數(shù)、超聲功率、粉碎度對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響較大，故選擇這4個因素對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

本研究結(jié)果顯示，隨著提取時間的延長，總維生素E的提取量先上升后下降，推測其原因可以與其易氧化有關(guān)，導(dǎo)致維生素E的化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞，提取量降低；隨著超聲功率變大，總維生素E的提取量不斷增加，但過強(qiáng)的超聲功率會破壞芡實(shí)中維生素E的結(jié)構(gòu)，故維生素E的提取率隨超聲功率的增強(qiáng)呈先上升后下降的趨勢；粒度過粗的芡實(shí)粉末由于與溶劑的接觸面積小，提取效率低，粒度過細(xì)的芡實(shí)粉末使得分子與分子間的吸附作用增強(qiáng)，故隨著芡實(shí)粉碎度的增加，維生素E的提取量也是呈先上升后下降的趨勢。

綜上所述，本文通過Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法成功優(yōu)化了芡實(shí)中總維生素E的提取工藝，且優(yōu)化后的提取工藝合理可行，可為芡實(shí)中總維生素E的開發(fā)與利用提供參考。