參附注射液對內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織炎癥的改善作用及抗炎機(jī)制研究Δ

劉霞，艾飛，褚春薇，陳向云，郭俊峰，楊毅，梅麗艷，苗紀(jì)飛，溫泉，葉森，黎暉#（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 55005；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽 55005；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 50006）

內(nèi)毒素休克屬于感染性休克，多因細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）導(dǎo)致，常伴隨急性肺損傷，甚至多器官衰竭[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，約50%內(nèi)毒素休克患者伴隨急性肺損傷，甚至急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）[2]。核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor κB，NF-κB）是炎癥因子轉(zhuǎn)錄的核心，NF-κB信號(hào)通路的過度激活可使炎癥發(fā)展成不可控狀態(tài)，NF-κB信號(hào)通路活化的標(biāo)志是P65、P50蛋白從細(xì)胞漿遷移至細(xì)胞核（該過程稱為核轉(zhuǎn)位），從而啟動(dòng)下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，故抑制其核轉(zhuǎn)位則可抑制過度的炎癥反應(yīng)[3-4]。

感染性休克屬中醫(yī)外感病“厥脫”范疇，用扶陽固脫的參附注射液有確切療效[5-7]。藥理研究表明，參附注射液對內(nèi)毒素休克模型大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的P65蛋白具有抑制作用[8]。但參附注射液是否能抑制內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織中P65蛋白的核轉(zhuǎn)位，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立內(nèi)毒素休克模型大鼠，觀察參附注射液對內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織炎癥的改善作用，檢測大鼠肺組織中P65、P50蛋白的表達(dá)和P65蛋白的核轉(zhuǎn)位以及大鼠血漿中腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)水平，以期為參附注射液的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Neofuge 1600R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；Ama 240高壓滅菌鍋（英國Astell公司）；EnSpire多功能酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）；DHP-9012恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；PowerPac300電泳儀、170-3930轉(zhuǎn)膜儀、CFX96熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）儀均購自美國Bio-Rad公司；5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

LPS（美國Sigma公司，批號(hào)：20160920）；參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170324，規(guī)格：10 mL）；肝素（海通藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170212136）；地塞米松注射液（艾美捷科技有限公司，批號(hào)：100129-201704，規(guī)格：10 mg/mL）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔單克隆抗體（內(nèi)參，批號(hào)：9100002004）、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）-辣根過氧化物酶標(biāo)記物（HRP）（批號(hào)：GR313248-1）均購自美國Abcam公司；H3兔單克隆核抗體（內(nèi)參，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SC-376769）；P65兔單克隆抗體（批號(hào)：9034P501D）、P50兔單克隆抗體（批號(hào)：9034P501D）均購自美國Cell公司；BCA蛋白定量試劑盒（上海貝博生物試劑公司，批號(hào)：BB18121）；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（華美生物工程有限公司，批號(hào)：CSB-E11987r）；核/漿蛋白分離試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20170605）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司，批號(hào)：AK6501）；qPCR擴(kuò)增試劑盒（天根生物科技有限公司，批號(hào)：FP209-02）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）液（美國Millipore公司，批號(hào)：1801501）。

1.3 動(dòng)物

SPF級健康SD大鼠，♂，體質(zhì)量為（220±20）g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0020。大鼠單籠喂養(yǎng)于22℃，相對濕度為55%的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，自由取食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方案經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作和取材均遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可管理辦法》規(guī)定進(jìn)行。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將48只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，暴露右頸總動(dòng)脈，插管連接生物技能系統(tǒng)（BL-420）以檢測血壓，取其中40只經(jīng)腹腔注射LPS（15 mg/kg）建立內(nèi)毒素休克模型大鼠，其余8只為正常組，注射與LPS等量的生理鹽水。觀察造模大鼠的動(dòng)脈壓直至達(dá)到休克狀態(tài)后（以血壓下降30%作為大鼠休克的指標(biāo)）[9]，將造模成功的大鼠分為模型組、地塞米松組（陽性對照，1 mg/kg，根據(jù)臨床用藥劑量換算而得）和參附注射液低、中、高劑量組（5、10、15 mL/kg，根據(jù)臨床用藥劑量的2.5、5、7.5倍換算而得），每組8只，腹腔注射給藥1次。

2.2 采集樣本

各組大鼠給藥24 h后，注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，心臟取血置于抗凝采血管，靜置1 h后4℃3 000 r/min離心（離心半徑為40 cm）10 min，取上清液于－80℃保存?zhèn)溆?。各組大鼠采血后迅速取出肺組織，生理鹽水洗凈，左肺用于PCR及Western blot分析，右肺固定于4%多聚甲醛，用于形態(tài)學(xué)觀察。

2.3 大鼠肺組織病理學(xué)觀察

對固定后的肺組織進(jìn)行常規(guī)脫水包埋，制備厚度為4 μm的石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后于顯微鏡下觀察各組肺組織結(jié)構(gòu)。每組隨機(jī)觀察3只大鼠的切片，每張切片隨機(jī)選出5個(gè)高倍視野，參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[10]，以肺泡充血、出血、中性粒細(xì)胞浸潤和肺泡間隔增厚程度等指標(biāo)進(jìn)行病理學(xué)評分（極輕度損傷：0分；輕度損傷：1分；中度損傷：2分；重度損傷：3分；嚴(yán)重?fù)p傷：4分），將4項(xiàng)指標(biāo)得分相加作為總分，病理學(xué)評分越高，說明肺組織損傷越嚴(yán)重。

2.4 大鼠肺組織中P65、P50 mRNA水平檢測

各組大鼠取20 mg肺組織，提取樣品總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA。以cDNA為模板，按qPCR擴(kuò)增試劑盒操作，以GAPDH為內(nèi)參基因，分別對P65、P50基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成。PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃反應(yīng)5 s；60 ℃反應(yīng)30 s；95 ℃反應(yīng)15 s；共反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)。采用 2－ΔΔct相對定量法[11]計(jì)算P65、P50 mRNA的表達(dá)水平。RT-PCR引物序列見表1。

表1RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of RT-PCR

2.5 大鼠肺組織中P65、P50蛋白表達(dá)水平檢測

各組大鼠取50 mg肺組織，加液氮研磨成粉末狀，加含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30 min，4℃12 000 r/min離心15 min（離心半徑為13.5 cm）后取上清液，即為蛋白樣品。所得蛋白樣品根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒檢測濃度后保存至－80℃?zhèn)溆?。將各組蛋白煮沸變性后，按每泳道30 μg質(zhì)量上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后分別加P65兔單克隆抗體（1∶1 000）、P50兔單克隆抗體（1∶1 000）和GAPDH兔單克隆抗體（1∶5 000）4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后，加羊抗兔IgG-HRP（1∶20 000）室溫孵育1 h，滴加ECL液后于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀進(jìn)行曝光顯影，采用Image J軟件分析光密度值，以GAPDH為內(nèi)參，以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參的光密度比值表示相應(yīng)蛋白的相對表達(dá)量。

2.6 大鼠肺組織中P65蛋白核轉(zhuǎn)位的檢測

肺組織細(xì)胞核、細(xì)胞漿中蛋白的提取步驟嚴(yán)格按核/漿蛋白分離試劑盒說明書進(jìn)行。各組大鼠取50 mg肺組織，加液氮研磨成粉末狀，加200 μL預(yù)冷的BufferA渦旋劇烈振蕩15 s，冰上放置15 min；加11 μL預(yù)冷的Buffer B渦旋劇烈振蕩5 s，冰上放置1 min；4℃12 500 r/min離心5 min后收集上清液，即為細(xì)胞漿蛋白。在離心沉淀物（細(xì)胞核）中加入100 μL預(yù)冷的Buffer C，超聲（頻率：200 W，功率：50 Hz）裂解2 min，冰上放置40 min，其間每隔10 min渦旋15 s；4℃12 500 r/min離心10 min，收集上清液，即為細(xì)胞核蛋白。細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白濃度測定、電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育及曝光顯影等操作步驟同“2.5”項(xiàng)下方法，其中一抗孵育時(shí)細(xì)胞漿蛋白內(nèi)參用GAPDH，細(xì)胞核蛋白內(nèi)參用H3。

2.7 大鼠血漿中TNF-α水平測定

采用ELISA對各組大鼠血漿中所含TNF-α水平進(jìn)行測定，測定方法嚴(yán)格按大鼠TNF-α ELISA試劑盒方法操作。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，兩組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果

正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔較薄，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無充血、出血和明顯的炎性細(xì)胞浸潤。與正常組比較，模型組大鼠肺泡間隔增厚，血管明顯充血（見圖1中↑），肺間質(zhì)見大量中性粒細(xì)胞浸潤（見圖1中□），病理學(xué)評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組和參附注射液低、中、高劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，無明顯出血，炎性細(xì)胞浸潤程度明顯改善，病理學(xué)評分均顯著降低（P＜0.01）。各組大鼠肺組織病理學(xué)變化見圖1，各組大鼠病理學(xué)評分結(jié)果見表2。

3.2 各組大鼠肺組織中P65、P50 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中P65、P50 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，地塞米松組和參附注射液低、中、高劑量組大鼠肺組織中P65、P50 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。各組大鼠肺組織中P65、P50 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果見表3。

3.3 各組大鼠肺組織中P65、P50蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中P65、P50蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組比較，地塞米松組和參附注射液中、高劑量組大鼠肺組織中P65、P50蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。各組大鼠肺組織中P65、P50蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表4。

3.4 各組大鼠肺組織中P65蛋白核轉(zhuǎn)位測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肺組織細(xì)胞核和細(xì)胞漿中P65表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，地塞米松組和參附注射液低、中劑量組大鼠肺組織細(xì)胞核和細(xì)胞漿中P65表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.001），說明地塞米松和參附注射液抑制了P65蛋白的核轉(zhuǎn)位。各組大鼠細(xì)胞核、細(xì)胞漿中P65蛋白表達(dá)電泳圖見圖3，測定結(jié)果見表5。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化（HE，×400）Fig 1 Pathological changes of lung tissue in rats ineach group（HE，×400）

表2 各組大鼠病理學(xué)評分結(jié)果（x±s，n＝8）Tab 2 Pathological score of rats in each group（x±s，n＝8）

表3 各組大鼠肺組織中P65、P50 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果（x±s，n＝8）Tab 3 mRNA levels of P65 and P50 in lung tissue of rats in each group（x±s，n＝8）

圖2 各組大鼠肺組織中P65、P50蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoregram of protein expression of P65 and P50 in lung tissue of rats in each group

表4 各組大鼠肺組織中P65、P50蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（x±s，n＝8）Tab 4 Protein levels of P65 and P50 in lung tissue of rats in each group（x±s，n＝8）

圖3 各組大鼠肺組織細(xì)胞核、細(xì)胞漿中P65蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 3 Electrophoregram of protein expression of P65 in nucleus and cytoplasm of lung tissue of rats in each group

3.5 各組大鼠血漿中TNF-α水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血漿中TNF-α水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，地塞米松組和參附注射液低、中、高劑量組大鼠血漿中TNF-α水平顯著降低（P＜0.001）。各組大鼠血漿中TNF-α水平測定結(jié)果見表6。

表5 各組大鼠肺組織細(xì)胞核、細(xì)胞漿中P65蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（x±s，n＝8）Tab 5 Protein expression of P65 in nucleus and cytoplasm of lung tissue of rats in each group（x±s，n＝8）

表6 各組大鼠血漿中TNF-α水平測定結(jié)果（x±s，n＝8）Tab 6 TNF-α level in plasma of rats in each group（x±s，n＝8）

4 討論

參附注射液為中藥復(fù)方注射液，其組方源自《傷寒論》四逆加人參湯，方中紅參為君藥，為扶正補(bǔ)虛之要藥，附子為臣藥，能溫通十二經(jīng)之陽氣，助君相之火以破寒結(jié)之痹；臨床上常用于感染性、失血性休克等陽氣脫失之癥，亦用于寒凝腹痛，驚悸怔忡等陽氣虛少之癥[5-7]。

LPS是引起內(nèi)毒素休克的常見病因，在內(nèi)毒素休克過程中，常伴隨著急性肺損傷，因此選用LPS建立內(nèi)毒素休克模型大鼠[1-2]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素休克模型大鼠急性肺損傷病理學(xué)形態(tài)主要表現(xiàn)為肺泡間隔水腫、肺泡隔毛細(xì)血管淤血明顯、大量中性粒細(xì)胞浸潤；內(nèi)毒素休克模型大鼠給予參附注射液后，可顯著減輕急性肺損傷的病理改變，為參附注射液改善內(nèi)毒素所致急性肺損傷提供了依據(jù)。

NF-κB信號(hào)通路是參與炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生炎癥因子的主要信號(hào)通路。NF-κB家族成員以同源或異源二聚體的形式存在，而其中最常見的二聚體形式為P65、P50二聚體，也稱為標(biāo)準(zhǔn)的NF-κB分子[12]。P65、P50二聚體通常以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)受到損傷因素的刺激時(shí)，抑制P65活性的NF-κB抑制蛋白（IκB）經(jīng)泛素化途徑降解，游離的P65、P50二聚體即向核內(nèi)遷移，與κB位點(diǎn)結(jié)合，從而啟動(dòng)炎癥因子TNF-α、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等轉(zhuǎn)錄[4，13]。過度激活免疫反應(yīng)致使炎癥發(fā)展為非可控狀態(tài)，從而導(dǎo)致器官功能衰竭甚至死亡。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液對肺損傷具有一定的治療作用，但作用機(jī)制尚不明確，仍待進(jìn)一步研究[14-18]。NF-κB信號(hào)通路活化的標(biāo)志為P65的核轉(zhuǎn)位[4]，而參附注射液是否能影響P65的核轉(zhuǎn)位，目前尚未見到相關(guān)報(bào)道，因此本課題不僅檢測了P65、P50蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，同時(shí)也檢測了P65的在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中的分布情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織中P65、P50 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，P65不僅在細(xì)胞漿中表達(dá)增多，細(xì)胞核內(nèi)P65的表達(dá)也顯著增加，提示原本分布于細(xì)胞漿中的P65大量向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，說明NF-κB信號(hào)通路激活。TNF-α是早期促炎因子，在感染性疾病中TNF-α常作為判斷病情嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)歸的指標(biāo)[19]。TNF-α啟動(dòng)子區(qū)含有κB結(jié)合位點(diǎn)，因此NF-κB信號(hào)通路的活化可增加TNF-α的轉(zhuǎn)錄和翻譯并分泌至細(xì)胞外，分泌出細(xì)胞外的TNF-α可再次激活NF-κB信號(hào)通路，加劇炎癥反應(yīng)[20-21]。

綜上所述，參附注射液對內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織炎癥具有改善作用，其作用機(jī)制與降低肺組織NF-κB信號(hào)通路中P65、P50 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，抑制P65的核轉(zhuǎn)位有關(guān)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及參考。