HPLC-DAD法同時測定柴黃片中6種成分的含量Δ

丁長玲，崔俊鳳，石效榮，徐洋洋，成文娜，張金杰，趙麗（.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥學部，山東濱州5660；.濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東濱州 5668；.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院疼痛科，山東濱州5660）

柴黃片質(zhì)量標準收載于2015年版《中國藥典》（一部）[1]，是由柴胡和黃芩經(jīng)現(xiàn)代工藝加工制備而成的中藥制劑，具有清熱解表之功效，臨床上用于治療風熱感冒引起的發(fā)熱、周身不適、咽喉腫痛、頭痛目眩等病癥[2]?，F(xiàn)行標準中只規(guī)定了黃芩中黃芩苷的含量測定，沒有規(guī)定柴胡中活性成分的含量控制，黃芩中主要活性成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量以及柴胡中的主要活性成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量高低均會影響制劑的功效。為了更好地控制藥品質(zhì)量，確保柴黃片的臨床療效，筆者采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法同時測定柴黃片中的黃芩（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素）和柴胡（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）中6種有效成分的含量，為全面評價該藥物的質(zhì)量提供一種簡便快速、準確可靠的檢驗方法，并為臨床應(yīng)用該制劑提供確切的質(zhì)量保障。

1 材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 HPLC儀、Agilent Technologies G1315D DADVL檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；XSE205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-700 DV超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

柴黃片（陜西盤龍制藥集團有限公司，批號20170812、20171216、20180623，規(guī)格：0.5 g）；6種對照品黃芩苷（批號：110715-201720，純度：93.5%）、漢黃芩苷（批號：110753-200411，純度：95.5%）、黃芩素（批號：111595-201306，純度：97.6%）、漢黃芩素（批號：111514-201605，純度：96.5%）、柴胡皂苷 a（批號：110777-201510，純度：93.2%）和柴胡皂苷 d（批號：110778-201205，純度：94.6%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；柴胡、黃芩藥材均購自安徽井泉集團中藥飲片有限公司（批號：分別為20170611、20180226），均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定室周鳳琴主任中藥師檢定為正品；乙腈為色譜純、磷酸為優(yōu)級純、乙醇為分析純、試驗用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品貯備溶液 精密稱取6種對照品適量，分別置于25 mL量瓶中，加入適量的50%乙醇，振搖，溶解后定容至刻度，搖勻，即得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的質(zhì)量濃度分別為0.948 8、0.414 8、0.393 9、0.407 2、0.404 5、0.386 3 mg/mL的對照品貯備溶液。

2.1.2 混合對照品溶液 分別精密量取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品貯備溶液各4.0、2.0、1.0、1.0、1.0、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，搖勻，得混合對照品溶液，每1 mL溶液中含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分別為379.52、82.96、39.39、40.72、40.45、38.63 μg。

2.1.3 供試品溶液 取本品10片，用手術(shù)刀片輕輕刮除包衣，精密稱定，研細；取約0.5 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入50%乙醇適量，30℃水溫超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）45 min，放冷；加50%乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于50 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 缺柴胡陰性對照溶液 取黃芩100 g，按照柴黃片相應(yīng)工藝制法制成100片，按“2.1.3”項下方法制成缺柴胡陰性對照溶液。

2.1.5 缺黃芩陰性對照溶液 取柴胡100 g，按照柴黃片相應(yīng)工藝制法制成100片，按“2.1.3”項下方法制成缺黃芩的陰性對照溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性、專屬性試驗

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-磷酸三乙胺水溶液（B，取三乙胺5 mL用水稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0）為流動相進行梯度洗脫（0～50 min，25%A→70%A；50～60 min，70%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）、277 nm（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素）；柱溫：30℃；進樣量：5 μL。精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液（批號：20170812）和陰性對照溶液各5 μL進樣分析，結(jié)果各檢測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子在0.90～1.10，理論板數(shù)以黃芩苷峰計均大于6 000；在供試品溶液的色譜圖上，在與對照品溶液黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d相應(yīng)的位置上，均有相同保留時間的色譜峰，陰性對照溶液在對應(yīng)保留時間處未見色譜峰，不干擾測定，表明系統(tǒng)的適用性良好及方法的專屬性良好。色譜見圖1、圖2、圖3。

圖1 混合對照品溶液高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed control solution

2.3 線性關(guān)系、檢測限、定量限考察

取混合對照品溶液1、5、10、15、20 μL，注入HPLC儀中，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，以對照品進樣量（μg）為橫坐標（x），對各成分的峰面積（縱坐標，y）進行線性回歸，計算出線性回歸方程。另將混合對照品溶液逐級稀釋，當信噪比3∶1時得檢測限，當信噪比為10∶1時得定量限，結(jié)果見表1。

2.4 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的色譜峰面積，計算其RSD分別為0.62%、0.71%、0.55%、0.67%、0.83%、0.79%（n＝6），表明該儀器的精密度良好。

圖2 供試品溶液高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of test sample

圖3 陰性溶液高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of negative solution

表1 6種成分的線性關(guān)系Tab 1 Linear relationship of 6 components

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一批供試品溶液（批號：20170812）5 μL，在“2.2”項色譜條件下，在配制后0、4、8、16、32、48 h進樣測定，記錄黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的色譜峰面積，計算其RSD分別為0.51%、0.57%、0.72%、0.64%、0.85%、0.93%（n＝6），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復性試驗

取批號為20170812的藥品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，記錄黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的峰面積，計算其含量的RSD分別為0.83%、0.80%、0.75%、0.69%、0.98%、1.02%（n＝6）。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取含量已知的柴黃片（批號：20170812）6份，分別置于100 mL量瓶中，分別精密加入0.948 8 mg/mL黃芩苷對照品溶液20.0 mL、0.414 8 mg/mL漢黃芩苷對照品溶液10.0 mL、0.393 9 mg/mL黃芩素對照品溶液5.0 mL、0.407 2 mg/mL漢黃芩素對照品溶液2.0 mL、0.404 5 mg/mL柴胡皂苷a 1.5 mL、0.386 3 mg/mL柴胡皂苷d 1.0 mL，加入50%乙醇適量，30℃水溫超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）45 min，放冷，加50%乙醇至刻度，搖勻；濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液在“2.2”項色譜條件下進樣5 μL，測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為20170812、20171216、20180623），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/片，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（mg/tablet，n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者參考文獻[2-4] 和對照品溶液的紫外掃描圖譜（190～400 nm），發(fā)現(xiàn)黃芩苷在278 nm、漢黃芩苷在276 nm、黃芩素在272 nm、漢黃芩素在276 nm波長處有最大吸收，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d在210 nm波長處有最大吸收，故本文在滿足含量測定要求的前提下，綜合考慮到峰形、分離度等因素，確定采用HPLC-DAD法，以277、210 nm分別為柴黃片中6種成分含量測定的波長，不但可避免雜質(zhì)干擾且靈敏度高。

3.2 流動相的選擇

筆者在預(yù)試驗過程中并參考文獻[5-9] 方法，分別考察了甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸三乙胺水溶液為流動相時進行等度和梯度洗脫對結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，在前4種流動相下各成分峰形和分離度均達不到要求，而以乙腈-磷酸三乙胺水溶液為流動相進行等度和梯度洗脫時，供試品溶液中的各檢測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子在0.90～1.10，理論板數(shù)均大于6 000，故本研究選擇乙腈-磷酸三乙胺水溶液作為流動相進行梯度洗脫。

3.3 提取方法的考察

筆者在進行樣品處理時首先參考了2015年版《中國藥典》（一部）中相應(yīng)的處理方法[1]，參考相關(guān)文獻[10-13] 及該處方的制備工藝，選用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、30%甲醇和50%甲醇作為提取溶劑，分別超聲30、45 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以50%乙醇作為溶劑，超聲處理45 min，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d提取效率更高，因此本研究選用50%乙醇超聲45 min作為提取方法。

3.4 含量測定6種指標性成分的選擇

柴黃片具有清熱解表功效，臨床上用于風熱感冒引起的發(fā)熱等病癥，其主要活性成分為黃酮類和皂苷化學成分，其中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 6種成分含量較高[14]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃芩的有效成分均具有廣譜抗菌、抗病毒及良好的抗炎作用，且該作用與黃芩提取物濃度呈正相關(guān)，呈現(xiàn)出清熱鎮(zhèn)痛功效[15]。柴胡中的有效成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d也具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌作用[16]。黃芩和柴胡活性明確，其中有效成分含量的高低是衡量柴黃片質(zhì)量的重要指標，也是影響藥效的主要因素。為了更好地保證柴黃片在臨床使用上的有效性和安全性，故筆者以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為指標評價柴黃片的質(zhì)量更為全面和合理。

3.5 含量結(jié)果分析

本試驗對3批柴黃片中的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d進行了含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一廠家不同批號之間含量測定結(jié)果有一定的差異，進一步說明了開展多種成分質(zhì)量控制的中成藥整體控制比以單一指標成分控制中成藥質(zhì)量更可靠[17]。如果對該藥品進行6種成分的質(zhì)量控制，就可以從源頭控制藥材質(zhì)量和制備過程，進而控制柴黃片的質(zhì)量，保證臨床療效。

綜上，本研究建立了HPLC-DAD法同時測定柴黃片中6種成分含量的方法；按照有效成分不低于3批制劑平均含量80%的要求，建議在柴黃片質(zhì)量控制標準中，每片含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d應(yīng)分別不低于69.0、15.0、8.0、3.0、2.0、1.5 mg。