雷公藤紅素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備工藝優(yōu)化及其表征Δ

屈子卉，張備，陳洋洋，閻雪瑩（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040）

雷公藤紅素（Celstrol，簡(jiǎn)稱Cel）是自雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）根部提取出的一個(gè)天然活性成分[1]，具有廣泛的藥理活性，如能抑制腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]，以及對(duì)免疫功能和神經(jīng)退行性疾病等具有較好的改善作用[3]。但是Cel毒副作用大，加上由于Cel具有水不溶性特點(diǎn)而導(dǎo)致其生物利用度低、體內(nèi)消除快，制約了其臨床應(yīng)用[4]。在納米給藥系統(tǒng)中，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（Nanostructured lipid carriers，NLC）不僅具有固體脂質(zhì)納米粒的優(yōu)點(diǎn)，并且解決了固體脂質(zhì)納米粒粒徑大、易凝膠化以及由于固體脂質(zhì)納米粒的晶體結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致的包封率低等問(wèn)題[5-6]。NLC可作為水不溶性抗癌藥物的載體，當(dāng)藥物通過(guò)靜脈或肌內(nèi)注射進(jìn)入機(jī)體后，由于NLC具有被動(dòng)靶向性，在腫瘤部位的分布將大大增加[7-8]。因此，將全身毒性大的藥物（如Cel）包載入NLC中，可提高其抗腫瘤作用并降低其全身毒性，這種思路和方法已被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療研究中。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法是一種綜合了數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，因其試驗(yàn)次數(shù)少、試驗(yàn)精度高等特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于新型給藥系統(tǒng)的處方篩選中[9]。故本研究以Cel為模型藥，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化Cel-NLC的制備工藝，為Cel的靶向抗腫瘤研究提供試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用于臨床的新型納米遞藥載體提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津公司）；W202B數(shù)控恒溫水浴鍋（上海申勝生物有限公司）；UV 9100紫外分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）；Nano-ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；JEM-2100透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；Unique-R20多功能超純水機(jī)（廈門(mén)銳思捷水純化技術(shù)有限公司）；Scientz-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HZS-HA恒溫水浴振蕩器（東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；BT25S分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；HJ-6A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

Cel對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：34157-83-0，純度：＞98%）；肉豆蔻酸異丙酯（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：110-27-0，純度：98%）；維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）、雙硬脂酸甘油酯、嵌段式聚醚F-68（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：9002-96-4、1323-83-7、9003-11-6）；SephadexG-50葡聚糖凝膠（瑞典法瑪西亞公司，批號(hào)：17-0033-01）；油酸、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂（天津市科密歐化學(xué)試劑公司）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Cel-NLC及空白NLC的制備

2.1.1 Cel-NLC的制備 結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10]確定制備方法，即稱取處方量的固體脂質(zhì)材料、液態(tài)脂質(zhì)材料和Cel對(duì)照品，置于20 mL燒杯中，70℃恒溫水浴使其充分熔融作為油相；另取處方量的嵌段式聚醚F-68和復(fù)合乳化劑于50 mL燒杯中，加適量水，70℃恒溫水浴攪拌，加熱到油相相同溫度，作為水相。待水相完全溶解后，將水相加入到同溫度的油相中，用恒溫磁力攪拌器在70℃條件下攪拌（1 500 r/min）60 min，使其充分乳化。趁熱將制得的初乳轉(zhuǎn)移至細(xì)胞破碎機(jī)中，在600 W下探頭超聲10 min，冷卻后用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，即得Cel-NLC，4℃保存。

2.1.2 空白NLC的制備 按“2.1.1”項(xiàng)下方法，油相中不加Cel制得空白NLC。

2.2 Cel的含量測(cè)定

2.2.1 溶液的制備 （1）Cel對(duì)照品溶液：取Cel對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，得到質(zhì)量濃度為520 μg/mL的Cel對(duì)照品溶液。（2）Cel-NLC供試品溶液：精密量取“2.1.1”項(xiàng)下的Cel-NLC 1.0 mL于10 mL量瓶中，用85%甲醇稀釋并定容至刻度，振搖混勻，然后用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。（3）陰性對(duì)照溶液：精密量取“2.1.2”項(xiàng)下的空白NLC 1.0 mL于10 mL量瓶中，用85%甲醇稀釋并定容至刻度，振搖混勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Dikma Diamonsil（鉆石一代）C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～12 min，85%A；12～20 min，85%→90%A；20～30 min，90%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：426 nm；進(jìn)樣量：20 μL。取“2.2.1”項(xiàng)下3種溶液，按此色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，理論板數(shù)按Cel峰計(jì)不低于7 000，待測(cè)成分與相鄰峰間分離度大于1.5，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下Cel對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋為Cel質(zhì)量濃度分別為520、390、260、130、26、6.5、0.65 μg/mL 的 Cel標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、Cel質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，Cel的線性回歸方程為：A＝15 051c－2 666（R2＝0.999 6），表明Cel在進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.65～520μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 制備低、中、高（4.06、10.15、20.30μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的Cel對(duì)照品溶液各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，同日內(nèi)每份樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)精密度試驗(yàn)的RSD分別為1.08%、0.75%、0.53%（n＝3），日間精密度試驗(yàn)的RSD分別為1.03%、1.24%、1.43%（n＝3），表明日內(nèi)、日間精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下Cel-NLC供試品溶液，放置0、3、6、9、12、24 h后，分別按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，Cel峰面積的RSD＝1.37%（n＝6），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取制備的同一批Cel-NLC樣品適量，共6份，按“2.2.1（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，Cel峰面積的RSD＝0.88%（n＝6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 精密量取空白NLC溶液0.5 mL，共9份，分別加入質(zhì)量濃度為10、30、50 μg/mL的Cel對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備3份，然后按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果，10、30、50 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度Cel的平均回收率分別為99.02%、99.89%、98.52%，RSD均小于2.0%（n＝3），表明該方法準(zhǔn)確度良好?；厥章蕼y(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.3 微型凝膠柱離心法測(cè)定Cel-NLC的包封率

2.3.1 微型凝膠柱的制備 將SephadexG-50葡聚糖凝膠用水浸泡24 h，置于4℃冰箱中封口，備用。取2.5 mL的注射器，去掉針頭和活塞，底部填入雙層圓形濾紙，然后加入充分溶脹的SephadexG-50葡聚糖凝膠，注射器外套一5 mL離心管，置于離心機(jī)中，以2 000 r/min離心2 min（下同），使其失水皺縮[11-12]（在注射器中呈斜面圓柱狀），待用，此時(shí)SephadexG-50葡聚糖凝膠高約2.3 cm。

2.3.2 微型凝膠柱對(duì)空白NLC過(guò)柱回收率的影響 分別精密吸取0.1、0.2、0.3 mL的空白NLC，緩慢注入微型凝膠柱的頂端，離心，收集濾液。繼續(xù)向微型凝膠柱中加入相同量磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）；以2 000 r/min離心2 min，收集洗脫濾液，重復(fù)以上操作4次，合并4次洗脫濾液，然后置于5 mL量瓶中，加PBS（pH 7.4）至刻度。另取相同量的空白NLC置于5 mL量瓶中，加PBS（pH 7.4）至刻度。用紫外分光光度計(jì)分別在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度，計(jì)算空白NLC的過(guò)柱回收率[過(guò)柱回收率（%）＝（過(guò)柱后溶液吸光度/未過(guò)柱溶液吸光度）×100%] 。0.1、0.2、0.3 mL空白NLC過(guò)柱后溶液的吸光度分別設(shè)為A1、A2、A3，未過(guò)柱溶液吸光度均設(shè)為A0，每批樣品重復(fù)測(cè)定3次。結(jié)果顯示，0.1、0.2、0.3 mL空白NLC的平均過(guò)柱回收率分別為（100.26±0.59）%、（99.91±0.81）%、（99.39±0.20）%（n＝3），均符合要求，表明微型凝膠柱本身對(duì)空白NLC幾乎不吸收，不會(huì)影響Cel-NLC包封率的檢測(cè)。微型凝膠柱對(duì)空白NLC的過(guò)柱回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 微型凝膠柱對(duì)空白NLC的過(guò)柱回收率測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 The column recovery rate of black NLC on microgel column（n＝3）

2.3.3 洗脫曲線的繪制 取Cel對(duì)照品溶液和Cel-NLC供試品溶液各0.1 mL，混合后置于微型凝膠柱頂端，離心，收集濾液，繼續(xù)向微型凝膠柱中加入0.2 mL PBS（pH 7.4）0.2 mL，離心，連續(xù)洗脫20次，每份洗脫液加甲醇0.5 mL破乳，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其中Cel含量，繪制洗脫曲線。結(jié)果顯示，Cel-NLC和游離Cel可完全分開(kāi)，洗脫0～4次的洗脫液為Cel-NLC，洗脫4～11次的洗脫液為蒸餾水，洗脫11～16次的洗脫液為游離Cel，故本研究中只需收集洗脫0～4次的洗脫液進(jìn)行破乳處理，用于測(cè)定Cel-NLC中Cel的含量。Cel對(duì)照品溶液和Cel-NLC供試品溶液的洗脫曲線見(jiàn)圖2。

圖2 Cel對(duì)照品溶液和Cel-NLC供試品溶液的洗脫曲線Fig 2 Elution curve of Cel control solution and Cel-NLC test solution

2.3.4 Cel-NLC包封率的測(cè)定 取Cel-NLC 0.2 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法連續(xù)洗脫4次，收集4次的洗脫液，置于5 mL量瓶中，加甲醇破乳并定容至刻度，然后按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定Cel-NLC包封的Cel含量（cNLC）。另取Cel-NLC 0.2 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇破乳并定容至刻度，然后再按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定總Cel含量（c總），并按下式計(jì)算其包封率：包封率（%）＝cNLC/c總×100%。重復(fù)操作3次。結(jié)果，測(cè)定3次的包封率分別為86.54%、85.59%、88.37%，平均包封率為86.83%，RSD＝1.63%（n＝3）。

2.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]，固態(tài)脂質(zhì)類型、液態(tài)脂質(zhì)類型、液態(tài)脂質(zhì)比例、脂質(zhì)材料用量、主藥用量、復(fù)合乳化劑類型、復(fù)合乳化劑比例、復(fù)合乳化劑用量、乳化時(shí)間、超聲時(shí)間等都會(huì)對(duì)NLC的包封率產(chǎn)生影響。因此，在本研究中將以NLC包封率為指標(biāo)，對(duì)上述10個(gè)因素進(jìn)行單因素考察。

2.4.1 固態(tài)脂質(zhì) 固定脂質(zhì)材料總量為100 mg[液態(tài)脂質(zhì)為肉豆蔻酸異丙酯，液態(tài)脂質(zhì)比例（占總質(zhì)量的比例，下同）為50%] ，主藥用量為10 mg，復(fù)合乳化劑用量為200 mg（嵌段式聚醚F-68與TPGS的質(zhì)量比為1∶1），乳化時(shí)間為40 min，超聲時(shí)間為10 min（功率：600 W，頻率：20 kHz），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備Cel-NLC?？疾旃虘B(tài)脂質(zhì)分別為單硬脂酸甘油酯、硬脂酸和雙硬脂酸甘油酯時(shí)對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果Cel-NLC的包封率分別為66.24%、49.54%、78.12%，故選擇雙硬脂酸甘油酯作為固態(tài)脂質(zhì)材料。

2.4.2 液態(tài)脂質(zhì) 固定脂質(zhì)材料總量為100 mg（固態(tài)脂質(zhì)為雙硬脂酸甘油酯，液態(tài)脂質(zhì)比例為50%），其余條件同“2.4.1”項(xiàng)下，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備Cel-NLC?？疾觳煌簯B(tài)脂質(zhì)（油酸、肉豆蔻酸異丙酯）對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果Cel-NLC的包封率分別為59.46%、78.19%，故選擇肉豆蔻酸異丙酯作為液態(tài)脂質(zhì)材料。

2.4.3 液態(tài)脂質(zhì)比例 固定液態(tài)脂質(zhì)為肉豆蔻酸異丙酯、固態(tài)脂質(zhì)為雙硬脂酸甘油酯，脂質(zhì)材料總量為100 mg，其余條件同“2.4.1”項(xiàng)下，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備Cel-NLC?？疾煲簯B(tài)脂質(zhì)比例分別為25%、30%、40%、50%、60%時(shí)對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果Cel-NLC包封率分別為38.94%、66.04%、81.84%、72.12%、43.21%，可見(jiàn)液態(tài)脂質(zhì)比例為40%時(shí)Cel-NLC包封率達(dá)到80%以上，故選擇液態(tài)脂質(zhì)比例40%為中值進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

2.4.4 脂質(zhì)材料用量 固定液態(tài)脂質(zhì)為肉豆蔻酸異丙酯、固態(tài)脂質(zhì)為雙硬脂酸甘油酯，液態(tài)脂質(zhì)比例為40%，其余條件同“2.4.1”項(xiàng)下，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備Cel-NLC。考察脂質(zhì)材料用量分別為60、100、140 mg時(shí)對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果Cel-NLC包封率分別為70.64%、85.38%、78.04%，故確定脂質(zhì)材料用量為100 mg。

2.4.5 主藥用量 固定脂質(zhì)材料總量為100 mg（液態(tài)脂質(zhì)為肉豆蔻酸異丙酯、固態(tài)脂質(zhì)為雙硬脂酸甘油酯，液態(tài)脂質(zhì)比例為40%），除主藥用量外的其余條件同“2.4.1”項(xiàng)下，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備Cel-NLC?？疾熘魉幱昧糠謩e為6、8、10、12 mg時(shí)對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果Cel-NLC包封率分別為85.38%、85.49%、83.53%、79.94%。結(jié)果顯示，當(dāng)主藥用量為6、8 mg時(shí)包封率均在85%以上，而主藥用量為10 mg時(shí)包封率下降，并且制得的Cel-NLC在放置1 d即出現(xiàn)沉淀，說(shuō)明穩(wěn)定性變差，包載量已過(guò)飽和，故最終選擇主藥用量為8 mg為中值進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

2.4.6 復(fù)合乳化劑類型 固定脂質(zhì)總量為100 g（液態(tài)脂質(zhì)為肉豆蔻酸異丙酯、固態(tài)脂質(zhì)為雙硬脂酸甘油酯，液態(tài)脂質(zhì)比例為40%），主藥用量為8 mg，復(fù)合乳化劑用量200 mg（固定其中一種乳化劑為嵌段式聚醚F-68，兩種乳化劑的質(zhì)量比為1∶1），乳化時(shí)間為40 min，超聲時(shí)間為10 min（功率：600 W，頻率：20 kHz），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備Cel-NLC。分別考察卵磷脂和TPGS分別與嵌段式聚醚F-68組成的復(fù)合乳化劑對(duì)Cel-NLC包封率的影響。結(jié)果Cel-NLC包封率分別為61.50%、83.19%，故選擇TPGS與嵌段式聚醚F-68共同作為復(fù)合乳化劑。

2.4.7 復(fù)合乳化劑比例 固定其他條件不變，考察嵌段式聚醚F-68與TPGS的質(zhì)量比分別為1∶1、3∶7、7∶3、4∶6時(shí)對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果Cel-NLC包封率分別為83.53%、81.84%、73.58%、82.64%，故選擇將嵌段式聚醚F-68與TPGS按1∶1的質(zhì)量比混合后作為復(fù)合乳化劑。

2.4.8 復(fù)合乳化劑用量 固定其他條件不變，考察復(fù)合乳化劑用量分別為100、200、280 mg時(shí)對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果Cel-NLC包封率分別為75.07%、82.73%、81.69%，可見(jiàn)復(fù)合乳化劑用量為200、280 mg時(shí)包封率均較高，但復(fù)合乳化劑用量為280 mg時(shí)制得的Cel-NLC在放置1 d出現(xiàn)了沉淀，故選擇復(fù)合乳化劑用量200 mg為中值進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.9 乳化時(shí)間 固定其他條件不變，考察乳化時(shí)間分別為40、60、80、100 min時(shí)對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果Cel-NLC包封率分別為75.07%、82.09%、77.48%、81.69%，將乳化時(shí)間控制在60 min時(shí)包封率最高，故選擇乳化時(shí)間為60 min制備Cel-NLC。

2.4.10 超聲時(shí)間 固定其他條件不變，考察超聲時(shí)間分別為6、8、10、12 min（功率：600 W，功率：20 kHz）對(duì)Cel-NLC包封率的影響。結(jié)果Cel-NLC包封率分別為69.79%、76.12%、81.81%、65.93%?？梢?jiàn)，超聲時(shí)間過(guò)短時(shí)包封率較小，且其粒徑較大；而超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，包封率也會(huì)降低，Cel-NLC顏色變深且易產(chǎn)生沉淀，故選擇超聲時(shí)間為10 min制備Cel-NLC。

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化Cel-NLC的制備工藝

2.5.1 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液態(tài)脂質(zhì)比例、復(fù)合乳化劑用量、主藥用量對(duì)包封率的影響較大。故本研究進(jìn)一步以液態(tài)脂質(zhì)比例（X1）、復(fù)合乳化劑用量（X2）、主藥用量（X3）作為考察因素，以包封率（Y）為考察指標(biāo)（響應(yīng)值），通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化Cel-NLC的制備工藝。因素與水平見(jiàn)表3，星點(diǎn)設(shè)計(jì)表及響應(yīng)值結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5.2 方程擬合 運(yùn)用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，軟件內(nèi)模型擬合功能顯示，采用二次多項(xiàng)式方程擬合效果較好，擬合方程為Y＝－803.660+7.006X1+5.158X2+61.773X3+0.012 6X1X2－0.005X1X3－0.063X2X3－0.121X12－0.013X22－3.138X32（R2＝0.898 2，P＜0.000 1）。計(jì)算出模型Y失擬項(xiàng)的平方和為5.75，P＝0.13＞0.05，表明本模型沒(méi)有失擬現(xiàn)象，可用于Cel-NLC處方的分析及預(yù)測(cè)。方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 因素與水平Tab 3 Factors and levels

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)表及響應(yīng)值結(jié)果Tab 4 Central composite design and response value result

由表5可知，此模型的F＝11.63（P＜0.001），表明此模型具有顯著性。并且，二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著的影響（P＜0.001），表明所得回歸方程能很好地預(yù)測(cè)Cel-NLC包封率隨考察因素的變化，佐證了本研究中選取的3個(gè)因素均為該模型的顯著性影響因素。

2.5.3 響應(yīng)面分析 以Design-Expert V 8.0.6軟件分別繪制3個(gè)因素兩兩交互對(duì)Cel-NLC包封率的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，通過(guò)響應(yīng)面曲線的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀反映出各因素對(duì)Cel-NLC包封率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各因素兩兩交互對(duì)Cel-NLC包封率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig 3 Contour map and response surface map for the effects of variables interaction on encapsulation rate of Cel-NLC

由圖3可知，包封率（Y）與液態(tài)脂質(zhì)比例（X1）、復(fù)合乳化劑用量（X2）以及主藥用量（X3）的關(guān)系密切。隨著X1升高、X2增加以及X3的增加，包封率先升高后降低，且趨勢(shì)明顯。因此在合適的液態(tài)脂質(zhì)比例、復(fù)合乳化劑用量、主藥用量下，包封率會(huì)有極大值，且應(yīng)位于響應(yīng)曲面的頂部。

2.5.4 響應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 在滿足Cel-NLC包封率最

大化條件下，利用Design-Expert V 8.0.6軟件優(yōu)化處方，得到最優(yōu)處方為液態(tài)脂質(zhì)比例38.89%、復(fù)合乳化劑用量195.58 mg、主藥用量7.86 mg?？紤]到實(shí)際操作，將Cel-NLC最優(yōu)處方調(diào)整為液態(tài)脂質(zhì)比例為39%、復(fù)合乳化劑用量為196 mg、主藥用量為8 mg。

2.5.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最優(yōu)化后的處方工藝條件，平行制備3批Cel-NLC，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定包封率。結(jié)果，3批Cel-NLC的包封率分別為87.23%、87.53%、86.89%，平均包封率為87.22%，RSD＝0.37%（n＝3）。與預(yù)測(cè)值85.13%的相對(duì)誤差為2.46%，低于5%，說(shuō)明優(yōu)選的工藝準(zhǔn)確、可靠。

2.6 Cel-NLC的表征

2.6.1 Cel-NLC的外觀 取按最優(yōu)處方工藝制備的Cel-NLC，用肉眼進(jìn)行外觀觀察。結(jié)果，Cel-NLC為黃色半透明的澄清液體，肉眼觀察外觀均勻，未見(jiàn)不溶性顆粒，Cel-NLC的外觀見(jiàn)圖4。

圖4 Cel-NLC的外觀Fig 4 Appearance of Cel-NLC

2.6.2 Cel-NLC的粒徑及Zeta電位 取按最優(yōu)處方工藝制備的Cel-NLC 1滴，加水1 mL稀釋后，置于納米粒度及Zeta電位分析儀中測(cè)定其粒度分布及Zeta電位。結(jié)果，測(cè)得粒徑為（41.2±1.1）nm、多分散指數(shù)（PDI）為0.14±0.28，Zeta電位為（－18.4±0.2）mV（n＝3），Cel-NLC的粒徑和Zeta電位分布圖見(jiàn)圖5。

2.6.3 Cel-NLC的微觀形態(tài)觀察 采用透射電子顯微鏡觀察Cel-NLC的微觀形態(tài)。結(jié)果，樣品中粒子呈類球形，粒徑大小與“2.6.2”項(xiàng)下檢測(cè)結(jié)果基本吻合，Cel-NLC的透射電鏡圖見(jiàn)圖6。

2.6.4 穩(wěn)定性考察 取3批Cel-NLC樣品，分別于室溫（25℃）和4℃冷藏下保存，分別于0、7、15、30 d取樣，肉眼觀察外觀變化，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果，Cel-NLC在4℃條件下放置30 d，外觀均勻，不分層，無(wú)沉淀；在25℃條件下放置15 d時(shí)，肉眼可見(jiàn)出現(xiàn)絮凝，但振搖后可恢復(fù)；在25℃條件下放置30 d時(shí)，已出現(xiàn)不可逆沉淀。以上結(jié)果表明，Cel-NLC在4℃冷藏下保存30 d內(nèi)比較穩(wěn)定。

圖5 Cel-NLC的粒徑和Zeta電位分布圖Fig 5 Particle size and Zeta-potential distribution of Cel-NLC

圖6 Cel-NLC的透射電鏡圖Fig 6 Picture of Cel-NLC by TEM

3 討論

在前期研究中，筆者曾分別采用熔融乳化超聲法、薄膜超聲分散法和溶劑擴(kuò)散法以相同質(zhì)量雙硬脂酸甘油酯、肉豆蔻酸異丙酯、Cel為油相，相同體積嵌段式聚醚F-68和TPGS為水相制備Cel-NLC。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用溶劑擴(kuò)散法制得的Cel-NLC體系不穩(wěn)定，4℃放置1 d即產(chǎn)生絮凝；采用薄膜超聲分散法制得的Cel-NLC粒徑較大，在190 nm左右，靜置易渾濁；而采用熔融乳化超聲法制備的Cel-NLC粒徑在40 nm左右，且納米體系穩(wěn)定，故最終選擇熔融乳化超聲法制備Cel-NLC。

包封率是NLC重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)[15]。對(duì)于不同性質(zhì)的NLC，適合的包封率測(cè)定方法各有不同。微柱離心法測(cè)定NLC包封率所需時(shí)間短、葡聚糖凝膠用量少，且對(duì)NLC的稀釋倍數(shù)小，可有效地將NLC與游離藥物分離[16]。在本研究中，筆者采用Sephadex G-50葡聚糖凝膠微柱離心和HPLC法聯(lián)合應(yīng)用測(cè)定Cel-NLC包封率，取得了較好的結(jié)果。在試驗(yàn)過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)離心處理時(shí)轉(zhuǎn)速對(duì)微型凝膠柱的形成具有重要作用，轉(zhuǎn)速過(guò)小凝膠失水量少，無(wú)法脫離注射器成柱，但轉(zhuǎn)速過(guò)高會(huì)導(dǎo)致微型凝膠柱斷裂，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)后最終確定以2 000 r/min離心2 min，此時(shí)既可使微型凝膠柱失水收縮，又不會(huì)引起凝膠的斷裂，從而達(dá)到理想的分離效果。

將單硬脂酸甘油酯中微量的雙硬脂酸甘油酯提純到80%以上可稱為雙硬脂酸甘油酯，其脂質(zhì)特性更優(yōu)于單硬脂酸甘油酯，在本研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)。本研究以雙硬脂酸甘油酯作為固態(tài)脂質(zhì)材料比單硬脂酸甘油酯包封率高11.9%，故選擇雙硬脂酸甘油酯作為固態(tài)脂質(zhì)材料。采用固態(tài)和液態(tài)混合脂質(zhì)材料作為載體，能增加NLC的晶格混亂度，解決了SLN脂質(zhì)粒徑變大、凝膠化趨勢(shì)，以及由于NLC的晶體結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致的包封率低等問(wèn)題[17-18]。在預(yù)試驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，用固態(tài)脂質(zhì)和液態(tài)脂質(zhì)作為載體制得的Cel-NLC在穩(wěn)定性、載藥量和PDI指數(shù)方面均優(yōu)于單獨(dú)使用固態(tài)脂質(zhì)材料，且粒徑在100 nm以內(nèi)，這提示制備的Cel-NLC具有被動(dòng)靶向性。乳化劑可以改變NLC中脂質(zhì)的結(jié)晶行為，避免脂質(zhì)裸露于顆粒的表面，降低顆粒間發(fā)生聚集的可能性，然而乳化劑用量過(guò)多也會(huì)影響NLC的穩(wěn)定性并會(huì)增加毒性[19]。嵌段式聚醚F-68是NLC常用的乳化劑，但在本研究制備Cel-NLC時(shí)，不斷增加嵌段式聚醚F-68用量，Cel-NLC的穩(wěn)定性均較低，而發(fā)現(xiàn)用TPGS和嵌段式聚醚F-68形成復(fù)合乳化劑后，Cel-NLC包封率和穩(wěn)定性都明顯提高，于是在本研究中采用復(fù)合乳化劑作為NLC的水相。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化了Cel-NLC的制備處方工藝，制得的Cel-NLC粒徑較小且分布均勻、包封率高，為Cel的后續(xù)開(kāi)發(fā)及研究拓寬了思路并提供了試驗(yàn)依據(jù)。