基于Ⅰ相代謝調(diào)控的葛根素微乳的制備及其藥動(dòng)學(xué)研究Δ

代麗萍，李維，卓虹伊，劉貴容，賀艷，胡一晨，宋雨#，鄒亮，（1.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 61005；.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610106；.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 61117；.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106）

葛根素（Puerarin）系從豆科植物野葛或甘葛干燥根中提取出的有效成分，其主要藥理作用為擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管、降低心肌耗氧量、改善微循環(huán)等，臨床廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療[1-2]。葛根素水溶性差，口服后由于首關(guān)效應(yīng)迅速被Ⅰ相代謝酶細(xì)胞色素P450（CYP）代謝[3-4]，導(dǎo)致葛根素以原型藥物入血的濃度較低，口服生物利用度降低，限制了其臨床應(yīng)用。許多專(zhuān)家學(xué)者對(duì)提高葛根素的溶解度和口服生物利用度的方法進(jìn)行了研究和探索，如進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾[5]、與其他藥物配伍合用[6]、制成磷脂復(fù)合物[7-8]、制成納米制劑[9]等。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，自微乳釋藥系統(tǒng)（Self-emulsifying drug delivery system，SMEDDS）能夠提高藥物的溶解度并增加藥物溶出，提高藥物的生物利用度[10-11]。SMEDDS是由藥物、油相、乳化劑和助乳化劑組成的口服固體或液體制劑，其中部分輔料對(duì)CYP酶系具有一定的抑制作用，可提高原型藥物的入血濃度，從而提高藥物的生物利用度[12-13]。本研究結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)以及參考相關(guān)研究[14]，選取具有抑制代謝酶活性的輔料，制備了具有Ⅰ相代謝調(diào)控作用（抑制CYP酶活性）的葛根素微乳（R-PR-ME），另外采用對(duì)Ⅰ相代謝無(wú)調(diào)控作用的輔料制備無(wú)Ⅰ相代謝調(diào)控作用的葛根素微乳（NR-PR-ME）；將R-PR-ME、NR-PR-ME和葛根素混懸液（PR-SP）分別灌胃大鼠，尾靜脈取血，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定血藥濃度，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，比較生物利用度，為提高葛根素生物利用度的口服制劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Angilent 1260 HPLC儀（美國(guó)安捷倫公司）；Zetasizer Nano ZSP納米粒度儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；ESJ120-4B電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；JN300-1氮吹儀（蘇州吉米諾儀器有限公司）；HC-2517高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州匯成科工貿(mào)有限公司）；Vortex Genius3漩渦混勻器（德國(guó)IKA公司）。

1.2 藥品與試劑

葛根素對(duì)照品（中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)：MUST-1611007，純度：99.71%）；葛根素原料藥（長(zhǎng)沙中仁生物科技有限公司，批號(hào)：171101，純度：98%）；聚山梨酯20（西隴化工股份有限公司）；丙三醇、聚乙二醇400（PEG400）、聚山梨酯80、對(duì)羥基苯甲酸（批號(hào)：201409-1601，純度：＞99.0%）均購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；油酸聚乙二醇甘油酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯均購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司；大豆油、聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremphor EL）均購(gòu)自上?？死敔栐噭┕荆患状?、乙腈（美國(guó)Sigma公司，色譜純）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量為（200±20）g，購(gòu)自四川成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2015-030。

2 方法與結(jié)果

2.1 油相、乳化劑和助乳化劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[14] 及前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油酸聚乙二醇甘油酯、聚山梨酯20、Cremphor EL、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、PEG400對(duì)Ⅰ相代謝酶有抑制作用，于是選擇油酸聚乙二醇甘油酯作為油相，聚山梨酯20、Cremphor EL作為乳化劑，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、PEG400作為助乳化劑進(jìn)行具有Ⅰ相代謝調(diào)控作用空白微乳處方的篩選和優(yōu)化，共設(shè)計(jì)了4種處方，分別是（1）油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：聚山梨酯20，助乳化劑：辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，記為處方1；（2）油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：Cremphor EL，助乳化劑：辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，記為處方2；（3）油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：聚山梨酯20，助乳化劑：PEG400，記為處方3；（4）油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：Cremphor EL，助乳化劑：PEG400，記為處方4。同時(shí)選擇理化性質(zhì)相似且無(wú)Ⅰ相代謝調(diào)控作用的輔料大豆油作為油相，聚山梨酯80作為乳化劑，甘油作為助乳化劑進(jìn)行無(wú)Ⅰ相代謝調(diào)控作用的空白微乳處方的優(yōu)化。

2.2R-PR-ME處方的確定

2.2.1 油相、乳化劑和助乳化劑的確定 采用Shah法制備空白微乳[15-16]。按“2.1”項(xiàng)下處方1、2、3、4的處方組成，照乳化劑和助乳化劑的質(zhì)量比（Km）為1∶1、2∶1、3∶1的比例稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量的乳化劑和助乳化劑，置于10 mL離心管中渦旋混勻。按質(zhì)量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9精密稱(chēng)取1 g混合乳化劑和油相，磁力攪拌混合均勻，緩慢滴加去離子水，記錄使混合相剛剛澄清時(shí)水的質(zhì)量以及形成微乳時(shí)各個(gè)組分的量。分別繪制Km為1∶1、2∶1、3∶1的偽三元相圖，篩選相圖中形成微乳面積最大的處方為最佳空白微乳處方，確定Km值，結(jié)果顯示，處方4不能形成澄清透明的制劑；處方1、2、3不同Km值的偽三元相圖分別見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 處方1不同Km值的偽三元相圖Fig 1 Pseudo-ternary phase diagram of different Km values for formula 1

圖2 處方2不同Km值的偽三元相圖Fig 2 Pseudo-ternary phase diagram of different Km values for formula 2

比較圖1、2、3中微乳面積發(fā)現(xiàn)，圖1A中微乳面積最大，即最佳空白微乳處方為油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：聚山梨酯20，助乳化劑：辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，Km：1∶1。且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，混合乳化劑-油相的質(zhì)量比為5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9時(shí)不能形成澄清透明的制劑。

圖3 處方3不同Km值的偽三元相圖Fig 3 Pseudo-ternary phase diagram of different Km values for formula 3

2.2.2 混合乳化劑-油相質(zhì)量比的確定 在空白微乳處方里加入過(guò)飽和的葛根素制成R-PR-ME，3 000 r/min離心10 min，取上清液用甲醇稀釋后于液相檢測(cè)，測(cè)得葛根素的量[16]，計(jì)算所制R-PR-ME的最大載藥量（DL＝M1/M2，其中M1為葛根素質(zhì)量，M2為R-PR-ME質(zhì)量）。結(jié)果顯示，當(dāng)混合乳化劑-油相質(zhì)量比為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4時(shí)所制R-PR-ME的最大載藥量分別為50.57、67.50、40.45、43.11 mg/g，確定混合乳化劑-油相的最佳質(zhì)量比為8∶2。

綜上，確定R-PR-ME的處方為油酸聚乙二醇甘油酯（油相）-聚山梨酯20（乳化劑）-辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（助乳化劑）的質(zhì)量比：2∶4∶4，載藥量為67.50 mg/g。

2.3NR-PR-ME處方的確定

以大豆油為油相，聚山梨酯80為乳化劑，甘油為助乳化劑，按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行偽三元相圖考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)Km為1∶1且混合乳化劑-油相質(zhì)量比為9∶1時(shí)才能形成澄清透明的微乳制劑。由此確定，NR-PR-ME處方為大豆油（油相）-聚山梨酯80（乳化劑）-甘油（助乳化劑）的質(zhì)量比：1∶4.5∶4.5。在該空白微乳中加入葛根素制成NR-PR-ME，測(cè)定其最大載藥量為61.32 mg/g。

2.4R-PR-ME和NR-PR-ME的表征

采用納米粒度儀測(cè)定R-PR-ME和NR-PR-ME的粒徑和多分散系數(shù)（PDI）。結(jié)果顯示，R-PR-ME的平均粒徑為（22.59±0.53）nm、PDI為 0.182±0.017（n＝3）；NR-PR-ME的平均粒徑為（15.45±1.06）nm、PDI為0.156±0.012（n＝3）。R-PR-ME和NR-PR-ME的粒徑分布圖見(jiàn)圖4。

圖4R-PR-ME和NR-PR-ME的粒徑分布圖Fig 4 Particle size distribution of R-PR-ME and NRPR-ME

2.5 生物樣品中葛根素的含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Global Chromatography C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水（15∶85，V/V）；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5.2 溶液的制備 ①對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品5.10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度為510.00μg/mL的對(duì)照品貯備液，再用甲醇稀釋?zhuān)瞥少|(zhì)量濃度分別為0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.55μg/mL系列對(duì)照品溶液。②內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱(chēng)取對(duì)羥基苯甲酸10.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度為400.00μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，臨用前用甲醇稀釋成20.00μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.5.3 血漿樣品的處理 冷凍血漿在室溫下融化，渦旋混勻，取血漿0.1 mL于離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，再加入0.4 mL的甲醇用以沉淀蛋白，渦旋振蕩2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，40℃氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)屑尤?.1 mL甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析。

2.5.4 方法專(zhuān)屬性 分別用大鼠空白血漿、大鼠空白血漿+葛根素對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)、灌胃后10 min的大鼠含藥血漿，按“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，葛根素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別是8.040 min和10.107 min，峰形對(duì)稱(chēng)，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾待測(cè)物質(zhì)的分離，理論板數(shù)以葛根素峰計(jì)不低于5 000，色譜圖見(jiàn)圖5。

2.5.5 線(xiàn)性關(guān)系、檢測(cè)限與定量下限 取100 μL大鼠空白血漿，置于1.5 mL離心管中，分別加入系列葛根素對(duì)照品溶液，使血漿中葛根素的質(zhì)量濃度分別為0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.55 μg/mL，再按照“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，以葛根素與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)（y），葛根素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。另以信噪比為3∶1時(shí)對(duì)應(yīng)的葛根素質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，回歸方程線(xiàn)性范圍最低點(diǎn)為定量下限。結(jié)果顯示，回歸方程為y＝0.285 5x+0.007 8（r＝0.998），葛根素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線(xiàn)性范圍為0.08～2.55μg/mL，檢測(cè)限為0.02μg/mL，定量下限為0.08μg/mL。

圖5 高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms

2.5.6 準(zhǔn)確度 按“2.5.5”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為 0.16、0.64、1.92 μg/mL的質(zhì)控樣品，各 5份，按照“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，代入回歸方程計(jì)算實(shí)測(cè)濃度，以實(shí)測(cè)濃度與加入濃度之比計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度分別為97.26%、97.13%、99.82%，RSD分別為1.48%、1.32%、1.28%（n＝5）。

2.5.7 提取回收率 按“2.5.5”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為0.16、0.64、1.92 μg/mL的質(zhì)控樣品，各5份，按照“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積為A1；同時(shí)以相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液未經(jīng)提取直接進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積為A2，以A1/A2計(jì)算提取回收率。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的提取回收率分別為72.14%、75.20%、78.63%，RSD分別為2.45%、2.03%、2.16%（n＝5），表明該方法的提取回收率良好。

2.5.8 精密度 按“2.5.5”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為 0.16、0.64、1.92 μg/mL的質(zhì)控樣品，各 5份，按照“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后，每日測(cè)定1次和連續(xù)測(cè)定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)RSD分別為3.68%、3.54%、2.09%（n＝5），日間RSD分別為5.17%、4.39%、4.18%（n＝3），均符合生物樣本分析方法的要求。

2.5.9 穩(wěn)定性 按“2.5.5”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為 0.16、0.64、1.92 μg/mL的質(zhì)控樣品，各 4份，按照“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后，分別室溫放置6 h、自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置24 h、凍融循環(huán)3次、－20℃冷凍7 d，考察不同存儲(chǔ)條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品室溫放置6 h葛根素的RSD均＜10%（n＝3），自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置24 h葛根素的RSD均＜7.0%（n＝3），凍融循環(huán)3次葛根素的RSD均＜10%（n＝3），－20℃冷凍7 d葛根素的RSD均＜15%（n＝3），表明生物樣本穩(wěn)定性良好。

2.6 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

分別將R-PR-ME、NR-PR-ME、PR-SP制備成含葛根素12 mg/mL的生理鹽水溶液。取SD大鼠18只，將大鼠隨機(jī)分為R-PR-ME組、NR-PR-ME組和PR-SP組，每組6只，禁食不禁水12 h，分別灌胃相應(yīng)藥物，根據(jù)制劑的最大溶解度和大鼠的最大給藥體積確定給藥劑量為120 mg/kg（以葛根素計(jì)）。分別在給藥前（空白）以及給藥后5、10、15、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、600 min尾靜脈取血0.3 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上層血漿，－20℃保存?zhèn)溆?。取血漿樣品，按照“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，代入回歸方程計(jì)算葛根素的濃度，繪制藥-時(shí)曲線(xiàn)；采用DAS 2.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)；采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。大鼠體內(nèi)葛根素的平均藥-時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖6，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

圖6 大鼠體內(nèi)葛根素的平均藥-時(shí)曲線(xiàn)Fig 6 Average blood concentration-time curves of puerarin in rats

表1 灌胃給藥后葛根素在大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of puerarin in rat plasma after intragastric administration（x±s，n＝6）

表1 灌胃給藥后葛根素在大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of puerarin in rat plasma after intragastric administration（x±s，n＝6）

注：與PR-SP組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與NR-PR-ME組比較，#P＜0.05Note：vs.PR-SP group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.NR-PR-ME group，#P＜0.05

參數(shù)cmax，μg/mL tmax，min AUC0-600 min，μg·min/mL AUC0-∞，μg·min/mL CL/F，mL/（min·kg）t1/2β，min MRT，min R-PR-ME組1.316±0.306＊11.667±2.357＊134.187±37.152＊#187.361±43.208＊#0.625±0.158＊365.880±101.250＊＊#155.068±33.204＊#PR-SP組0.425±0.106 21.660±4.082 49.623±12.143 75.217±16.565 2.127±0.248 80.063±21.189 60.524±14.086 NR-PR-ME組1.082±0.294＊10.833±1.863＊65.145±18.762 131.675±32.017＊1.084±0.324＊283.280±80.940＊100.264±27.683＊

由圖6顯示，葛根素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)屬于二室模型。由表1結(jié)果顯示，與PR-SP組比較，R-PR-ME組和NR-PR-ME組大鼠體內(nèi)的葛根素的cmax、AUC、t1/2β、平均滯留時(shí)間（MRT）明顯增加，tmax明顯縮短，消除率（CL/F）明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。以PR-SP為參比制劑，R-PR-ME的相對(duì)生物利用度為270.41%，NR-PR-ME的相對(duì)生物利用度為131.28%。R-PR-ME組大鼠體內(nèi)的葛根素的AUC、t1/2β和MRT均明顯高于NR-PR-ME組（P＜0.05），以NR-PR-ME為參比制劑，R-PR-ME的相對(duì)生物利用度為205.98%。

3 討論

CYP酶系在肝臟及腸道含量豐富，參與眾多藥物的Ⅰ相代謝，明顯降低了CYP底物藥物的口服生物利用度。本文從代謝調(diào)控著手，以葛根素為研究對(duì)象，采用對(duì)CYP酶系活性有抑制作用的輔料制備了具有Ⅰ代謝調(diào)控作用的微乳來(lái)提高藥物的口服生物利用度，并采用偽三元相圖和以載藥量為指標(biāo)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化。本研究結(jié)果顯示，成功制得R-PR-ME，且其載藥量高、穩(wěn)定性好、粒徑小且分布均勻，同時(shí)本文采用大鼠模型比較了R-PR-ME、NR-PR-ME、PR-SP的藥動(dòng)學(xué)特征，由藥動(dòng)學(xué)結(jié)果可知，與PR-SP比較，R-PR-ME和NR-PR-ME的AUC、cmax、t1/2β和MRT均明顯增加，CL/F明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。以NR-PR-ME為參比制劑，R-PR-ME相對(duì)生物利用度為205.98%，由此說(shuō)明R-PR-ME中的輔料油酸聚乙二醇甘油酯、聚山梨酯20、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯可能通過(guò)抑制肝腸代謝酶CYP的活性，減少了葛根素在體內(nèi)被CYP酶系的代謝，增加了葛根素的口服生物利用度，表明本文基于代謝調(diào)控增加葛根素口服生物利用度的思路可行。另外本文制備的NR-PR-ME相對(duì)于PR-SP也提高了葛根素的口服生物利用度，且在體內(nèi)快速達(dá)到峰值，其原因可能是自微乳系統(tǒng)通過(guò)增加葛根素的溶解性、穩(wěn)定性以及淋巴循環(huán)，促進(jìn)了葛根素的胃腸道吸收，從R-PR-ME組、NR-PR-ME組的MRT均延長(zhǎng)可以看出自微乳釋藥系統(tǒng)具有緩釋作用，這與前人的研究結(jié)果一致[17]，也表明了本文制備自微乳釋藥系統(tǒng)的工藝可靠。至于R-PR-ME對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞攝取、細(xì)胞毒性等方面的影響有待進(jìn)一步研究。

綜上，本文從代謝調(diào)控出發(fā)，制備了具有Ⅰ代謝調(diào)控作用的葛根素微乳并研究其大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，為提高葛根素口服生物利用度和葛根素的劑型開(kāi)發(fā)提供了參考。