聚焦超聲治療對外陰低級別鱗狀上皮內病變模型大鼠外陰皮膚缺氧誘導因子1α、血管內皮生長因子及突變型p53表達的影響

范藝巾，唐華均，劉 瑤，李成志

(重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學工程學重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016)

外陰鱗狀上皮內病變是局限于外陰鱗狀上皮內且有進展為浸潤癌潛在風險的癌前病變，也稱為外陰鱗狀上皮內瘤變(vulvar squamous intraepithelial neoplasia， VIN)、外陰鮑恩病和原位癌，臨床多表現(xiàn)為外陰瘙癢、皮膚破損及潰瘍等[1]，2014年WHO女性生殖器腫瘤分類[2]將其分為低級別鱗狀上皮內病變(low grade squamous intraepithelial lesion， LSIL)、高級別鱗狀上皮內病變(high grade squamous intraepithelial lesion， HSIL)和分化型外陰上皮內瘤變。近年外陰鱗狀上皮內病變發(fā)病率逐年升高，且患者更趨于年輕化[1,3]。藥物治療、物理治療及外科手術是目前臨床治療外陰鱗狀上皮內病變的主要方式，但治療后復發(fā)率仍為25%～50%，且患者對手術治療的依從性較差[4]。聚焦超聲治療具有治療時間短、術后恢復快、安全性高等優(yōu)點[5-6]，可安全、無創(chuàng)、有效地治療129/J型外陰上皮內瘤變模型小鼠[7-8]。 Jia等[9]采用聚焦超聲治療HSIL后6個月，89%患者癥狀緩解，組織病理學表現(xiàn)基本恢復正常，無進展為外陰浸潤癌者。本研究建立大鼠外陰LSIL模型，探討聚焦超聲治療對模型大鼠外陰皮膚中缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)及突變型p53(mutant type p53， mtp53)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立 選取6～8周齡SPF級雌性SD大鼠28只[由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號:SYXK(渝)2017-0023]，體質量160～180 g，平均(170.30±7.16)g。參考本課題組前期研究[10]方法，通過機械刺激聯(lián)合0.5%二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenzanthracene, DMBA)丙酮溶液涂抹，于每周固定時間進行實驗處理，共14周，建立SD大鼠外陰LSIL模型。將28只模型大鼠隨機分為治療組和對照組，每組各14只。

1.2 聚焦超聲治療 對治療組大鼠以0.6%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后保定于操作臺，常規(guī)備皮、涂抹超聲耦合劑。采用海極星CZF型超聲波婦科治療儀，以5～10 mm/s恒定速度連續(xù)直線輻照，輻照區(qū)域包括外陰病變區(qū)及其周圍組織5 mm范圍內區(qū)域，頻率10.20 MHz,功率2.5 W，焦距3.5 mm。輻照過程中采用泰仕TES-1310測溫儀監(jiān)測表皮溫度，達40℃時則停止輻照[7]。對照組大鼠給予超聲假輻照，治療儀無功率輸出。

1.3 組織病理學觀察 分別于模型建立后及聚焦超聲治療后4周，以直徑3 mm的皮膚鉆環(huán)取大鼠外陰皮膚，置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)再脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，采用Olympus BX40型光學顯微鏡觀察組織病理學變化。

1.4 免疫組織化學檢測 聚焦超聲治療后4周，另取大鼠外陰皮膚，制備石蠟塊切片，脫蠟及脫水后，行抗原修復。在室溫避光條件下，于3%雙氧水溶液中孵育25 min，滴加3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)200 μl，室溫封閉30 min；加入用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline， PBS)配制好的一抗，HIF-1α、VEGF、mtp53抗體工作濃度分別為1∶400、1∶1 000、1∶100，以PBS漂洗后，再滴加50 μl與一抗相應種屬的二抗，最后滴加100 μl二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色液進行顯色，并脫水封片，分別用于HIF-1α、VEGF及mtp53檢測。采用Olympus BX40型光學顯微鏡進行觀察并采集圖像，通過IPP 6.0軟件進行光密度分析；在高倍(×400)鏡下從每張切片中隨機選取5個高倍視野，計算平均光密度值，代表蛋白的相對表達強度。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗比較2組間HIF-1α、VEGF及mtp53表達的差異；計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗比較2組大鼠外陰組織病理結果的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗處理14周后，2組模型大鼠外陰皮膚組織病理學檢查均出現(xiàn)LSIL病理改變，證實模型建立成功，見圖1。

2.1 聚焦超聲治療后大鼠外陰組織病理學變化 超聲輻照/假輻照后4周，治療組13只(13/14，92.86%)大鼠外陰皮膚基本恢復正常結構(圖2A)，1只(1/14，7.14%)仍表現(xiàn)為LSIL；對照組4只(4/14，28.57%)大鼠仍表現(xiàn)為LSIL，10只(10/14，71.43%)進展為HSIL(圖2B)。2組間外陰皮膚組織病理結果差異有統(tǒng)計學意義(χ2=24.80，P<0.001)。

2.2 聚焦超聲治療后大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達 HIF-1α和VEGF的表達位于細胞質和細胞膜，mtp53的表達位于細胞核，治療組染色較淺而對照組顏色較深，見圖3。超聲輻照/假輻照后4周，治療組大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達與對照組相比均明顯減低(P均<0.001)，見表1。

表1 免疫組織化學檢測2組外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達(平均光密度值，×10-2，±s，n=14)

表1 免疫組織化學檢測2組外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達(平均光密度值，×10-2，±s，n=14)

組別HIF-1αVEGFmtp53治療組0.04±0.011.29±0.080.03±0.02對照組1.12±0.233.15±0.690.93±0.15t值11.236.5513.66P值<0.001<0.001<0.001

3 討論

聚焦超聲治療是一種新興的非侵入性局部治療技術，現(xiàn)已廣泛用于治療多種腫瘤及非腫瘤性疾病[11-14]。其原理是體外發(fā)射低能量超聲波，使之透過表層組織聚焦于特定靶區(qū)，在通過熱效應、機械效應和空化效應等導致病變組織變性、壞死的同時，保持局部解剖結構的完整性[11]。Wu等[15]報道，聚焦超聲治療外陰上皮內非瘤樣病變的總有效率達93.38%，且無嚴重并發(fā)癥發(fā)生。Jia等[8]采用聚焦超聲治療129/J型VIN模型小鼠，治療后2個月總有效率為100%(35/35)。本研究建立外陰鱗狀上皮內病變大鼠模型，發(fā)現(xiàn)聚焦超聲治療后4周92.86%(13/14)的治療組模型大鼠外陰皮膚基本恢復正常組織結構；而對照組大鼠中，28.57%(4/14)仍表現(xiàn)為LSIL，71.43%(10/14)進展為HSIL；表明聚焦超聲治療外陰LSIL安全、有效，聚焦超聲有助于阻止甚至逆轉LSIL向HSIL發(fā)展。

低氧是實體腫瘤及炎癥性疾病組織微環(huán)境中的病理生理特征之一。HIF-1α是在低氧條件下調控氧平衡的主要轉錄因子，在人及哺乳動物細胞內廣泛存在。在正常生理狀態(tài)下，細胞中HIF-1α蛋白極少；但當細胞處于持續(xù)缺氧狀態(tài)時，降解HIF-1α的泛素化途徑被阻斷，蛋白表達量明顯增加且蛋白穩(wěn)定性增強；且HIF-1α可直接激活VEGF、促紅細胞生成素和胰島素樣生長因子等下游靶基因的轉錄和表達，從而調控血管新生、細胞增殖及生存、能量代謝、腫瘤侵襲及轉移等，這一系列生物學效應對細胞自身調節(jié)、腫瘤微血管形成及癌前病變的發(fā)生具有重要意義[16]。HIF-1α在膀胱癌、宮頸癌、子宮內膜癌、肺癌、食管癌、口咽癌和皮膚癌等多種腫瘤均呈高表達，某些癌前病變也存在HIF-1α高表達[17]。杜善平等[18]研究發(fā)現(xiàn)，正常外陰組織中HIF-1α蛋白幾乎無表達，而在VIN中HIF-1α表達升高。本研究結果顯示，治療組大鼠外陰皮膚中HIF-1α表達較對照組明顯降低，提示聚焦超聲治療可通過下調HIF-1α表達而改善局部組織氧平衡狀態(tài)。

圖1 外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚組織病理圖 鱗狀上皮增厚，上皮下半部細胞密度增加，極性輕度紊亂、大小不等，輕度異形性，可見核分裂象(HE，×100) 圖2 超聲輻照/假輻照后外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚組織病理學變化(HE，×100) A.治療組大鼠超聲輻照后4周外陰皮膚基本恢復正常； B.對照組大鼠超聲假輻照后4周進展為HSIL，可見異常角化珠(箭)

圖3 超聲輻照后4周外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達情況(×400) A、B.對照組大鼠HIF-1α染色較深(A，黑箭)，治療組大鼠HIF-1α染色較淺(B，白箭)； C、D.對照組VEGF染色較深(C，黑箭)，治療組大鼠VEGF染色較淺(D，白箭)； E、F.對照組mtp53染色深(E，黑箭)，治療組mtp53染色較淺(F，白箭)

VEGF是調節(jié)血管生成的主要因子，受多種細胞因子調控；高表達的HIF-1α蛋白可大量激活VEGF轉錄，從而促使局部組織新生血管形成。VEGF通過與VEGF受體1/FAM 樣酪氨酸激酶1和VEGF受體2 /胎肝激酶1特異性結合，激活并誘導血管內皮細胞進行有絲分裂，從而增殖產(chǎn)生大量血管內皮細胞[19]。Li等[20]研究報道，VEGF在正常人外陰表皮內少部分區(qū)域呈弱陽性表達，而在VIN患者外陰表皮內大部分區(qū)域呈強陽性表達。本研究結果顯示，與對照組比較，治療組大鼠外陰皮膚中VEGF表達明顯降低，提示聚焦超聲治療可減弱VEGF表達，從而在一定程度上減少LSIL局部新生血管形成。

p53基因被認為是人類基因組的“守護者”，其中野生型p53基因具有較強的抑癌功能，而mtp53基因不但喪失了抑癌功能，還可通過激活下游各類靶基因解除對細胞周期的調控，促進細胞增殖并提高細胞存活率，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21]。侯學濤等[22]研究報道，正常外陰組織發(fā)生外陰鱗狀上皮內病變至進展為外陰鱗狀細胞癌過程中，mtp53蛋白陽性表達率逐漸升高；表明mtp53與外陰鱗狀上皮內病變的發(fā)生有關，檢測mtp53表達有助于早期診斷外陰惡性病變。本研究結果顯示，治療組大鼠外陰皮膚中mtp53表達較對照組明顯降低。

總之，聚焦超聲治療大鼠外陰LSIL安全、有效，超聲輻照后大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達降低可能為其作用機制。