光動(dòng)力對(duì)瘢痕疙瘩的抑制效果研究

游傳華，王一賀，陸雪飛

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 整形美容外科，海南 海口，570102；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 麻醉科，海南 ?？?，570102）

瘢痕疙瘩是臨床上常見(jiàn)的皮膚組織的良性纖維增生性疾病，是一種以成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)大量堆積為主要特征的疾病[1]。目前，臨床治療方法多種多樣，例如手術(shù)切除，藥物注射，激光，放療，物理治療等等，但復(fù)發(fā)率較高，總體療效不滿意[2]，仍需要尋求一種療效確切、不良反應(yīng)率和復(fù)發(fā)率低的治療方法。我們采用氨基酮戊酸光動(dòng)力療法(ALA—PDT)對(duì)瘢痕疙瘩模型進(jìn)行試驗(yàn)研究，取得一定效果，報(bào)道如下：

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康裸鼠15只。

1.2 試劑與儀器

光敏劑：外用鹽酸氨酮戊酸（5-ALA，商品名艾拉，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20070027）

激光設(shè)備：光動(dòng)力治療儀（武漢亞格光電技術(shù)有限公司，型號(hào)LED-EB）

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物瘢痕模型建立

瘢痕疙瘩來(lái)源：患者外傷后1～2 年內(nèi)形成的瘢痕疙瘩，未使用任何干預(yù)治療，經(jīng)手術(shù)切除，病理檢查證實(shí)，患者知情同意。

瘢痕模型建立：消毒環(huán)境下，去除瘢痕疙瘩表皮及基底部分正常組織，依次以1.0cm內(nèi)徑環(huán)鉆和手術(shù)刀切割，形成直徑1.0cm，高度0.5cm的圓柱形瘢痕疙瘩顆粒。在裸鼠背部?jī)蓚?cè)間隔中線1.5cm處分別作兩條縱行約1.5cm切口，深度達(dá)鼠背肌筋膜表面，創(chuàng)周稍作分離，將瘢痕疙瘩顆粒埋置于皮下，縫合2-3針。每只裸鼠背側(cè)埋置4個(gè)瘢痕疙瘩，此后可形成15周～20周穩(wěn)定的病理性瘢痕[3]。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將15只裸鼠由1～15依次編號(hào)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組三組，共計(jì)60處瘢痕疙瘩，每組5只20處瘢痕疙瘩。

2.3 試驗(yàn)方法

分別于第4、8、12周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組1裸鼠瘢痕疙瘩以棉片濕敷濃度10%氨基酮戊酸溶液30分鐘，實(shí)驗(yàn)組2濕敷濃度20%氨基酮戊酸溶液30分鐘，對(duì)照組濕敷生理鹽水棉片，隨后均采用輸出波長(zhǎng)635nm的連續(xù)波激光照射20 min，照射功率密度100J/cm2，光斑直徑1cm。

2.4 標(biāo)本采集

于第6、10、14周選擇三組15只裸鼠，每只切取1處背部相同部位的瘢痕疙瘩及周圍部分正常皮膚，切取深度為表皮至肌筋膜表面，切取后裸鼠背創(chuàng)面縫合消毒處理。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 外觀及鏡下觀

2.5.2 瘢痕指數(shù) 切取的瘢痕疙瘩剔除周圍脂肪和肌肉組織，自表皮至基底由正中縱行切開(kāi)成兩部分，一部分4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，5μm厚度切片，HE染色后置于低倍光鏡下檢測(cè)，測(cè)量瘢痕組織凸起最高點(diǎn)至肌筋膜表面厚度（H1），周圍正常組織表皮面至肌筋膜厚度（H2），計(jì)算瘢痕指數(shù)HI（HI=H1/H2）。

2.5.3 成纖維細(xì)胞數(shù)量（NA） Masson染色切片低倍光鏡下檢測(cè)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)藍(lán)染的膠原纖維數(shù)量,結(jié)果取均數(shù)。

2.5.5 Western blot檢測(cè) 定量瘢痕標(biāo)本粉碎研磨，取各組勻漿胰酶消化洗滌離心，細(xì)胞沉淀加入裂解液提取蛋白。經(jīng)配膠、泡膜、轉(zhuǎn)膜、封閉、顯影后拍照留存，以圖像分析軟件Image j采集數(shù)據(jù)并通過(guò)Graph pad 6.0分析數(shù)據(jù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間采用t檢驗(yàn)和重復(fù)測(cè)量的方差分析。P＜0.05表示有顯著差異。

3 結(jié) 果

3.1 外觀及鏡下觀

第6周三組模型外觀差異不明顯，第9周~10周后，實(shí)驗(yàn)組2瘢痕萎縮情況明顯優(yōu)于觀察組，也優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組1，硬度及充血狀況均有所改善。電鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核膜萎縮，漿內(nèi)存在大量空泡，線粒體數(shù)量減少，體積增大；對(duì)照組細(xì)胞核膜平整光滑，線粒體豐富。

3.2 瘢痕指數(shù)和成纖維細(xì)胞數(shù)量

各組數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)ALAL-PDT治療1次治療后，瘢痕指數(shù)（表1）和成纖維細(xì)胞數(shù)量（表2）雖有所下降，但不顯著（P＞0.05）；自2、3次治療，對(duì)照組2瘢痕組織瘢痕指數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組1、2間也有差異，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 瘢痕指數(shù)（n=15）

表2 瘢痕組織成纖維細(xì)胞數(shù)量（n=15）

3.3 TG-β1 lOD值

三組中TGF-β1表達(dá)均為陽(yáng)性，對(duì)照組陽(yáng)性染色顆粒的數(shù)目、染色強(qiáng)度、密集程度均明顯高于實(shí)驗(yàn)組（表3），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明實(shí)驗(yàn)組治療后瘢痕疙瘩TGF-β1顯著降低。

表3 瘢痕組織TGF-β1 IOD值（n=15）

3.4 Western blot檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè)α-SMA在三組細(xì)胞中均有表達(dá)，其中對(duì)照組表達(dá)較高，實(shí)驗(yàn)組2表達(dá)量最低，各組件對(duì)比均有差異，實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組顯著差異。

4 討 論

瘢痕疙瘩主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞紊亂和膠原纖維過(guò)度增生[5]，呈現(xiàn)失代償、無(wú)調(diào)控性生長(zhǎng)，普通手術(shù)切除往往造成新?lián)p傷，修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)，一定條件下成纖維細(xì)胞新一輪增殖并重新生成瘢痕疙瘩。如何控制成纖維細(xì)胞生物合成和增殖、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，是瘢痕疙瘩生長(zhǎng)形成抑制的關(guān)鍵。

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩植入裸鼠體內(nèi)能在約20周內(nèi)保持其原有的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征[6]，建立裸鼠瘢痕疙瘩模型是可行的，通過(guò)PDT治療后瘢痕相關(guān)指標(biāo)分析，可以推斷出PDT對(duì)瘢痕疙瘩的可能作用機(jī)制。

瘢痕組織細(xì)胞代謝較其他組織旺盛，對(duì)光敏劑的吸收也高于其他組織，這種特異性作用使得瘢痕可作為光敏劑靶細(xì)胞。ALA外敷30分鐘后部分透皮吸收，在靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換成原卟啉IX(PpIX),經(jīng)635nm波長(zhǎng)激光照射后激發(fā)，PpIX發(fā)生Ⅰ、Ⅱ型光動(dòng)力反應(yīng)，從單重態(tài)系間激發(fā)到三重態(tài)，繼而形成羥自由基和單態(tài)氧（1O2），這兩種產(chǎn)物造成自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和氧化損傷[7]，瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞占據(jù)吸收光敏劑的主導(dǎo)地位，損傷直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，造成瘢痕疙瘩的萎縮，達(dá)到治療的目的。

本研究中，治療后2周瘢痕厚度即開(kāi)始降低，微血管數(shù)量及成纖維細(xì)胞數(shù)量均減少，鏡下膠原纖維排列較規(guī)則有序，表明在治療早期瘢痕增生已得到抑制，這可能就是由氧化損傷的毒性反應(yīng)所引起的。而在治療后期治療組瘢痕退縮程度仍遠(yuǎn)快于對(duì)照組，則表明可能并非單一由氧化反應(yīng)誘發(fā)細(xì)胞凋亡引起作用。皮膚真皮組織病理分類為上皮組織，瘢痕疙瘩為間葉組織，瘢痕增生過(guò)程中涉及上皮組織到間葉組織的轉(zhuǎn)化過(guò)程，有研究表明TGF-β1可促進(jìn)瘢痕疙瘩表皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[8]，而α-SMA是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中成纖維細(xì)胞的特異性表達(dá)蛋白，也是使TGF-β1/Smad信號(hào)通路發(fā)生作用的重要分子蛋白[9]。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組TGF-β1及α-SMA顯著低于對(duì)照組，通過(guò)調(diào)控上游信號(hào)，減少上皮組織分泌細(xì)胞因子及趨化因子，誘導(dǎo)降低間葉組織特異性蛋白α-SMA、波形蛋白等表達(dá)，從而抑制EMT的過(guò)程，阻止瘢痕化進(jìn)程。據(jù)此分析，ALA-PDT能夠破壞成纖維細(xì)胞合成進(jìn)程，抑制成纖維細(xì)胞形成、增殖及膠原等胞外基質(zhì)產(chǎn)生，最終抑制瘢痕增殖。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究表明ALA-PDT作用下瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞數(shù)量降低，瘢痕增生明顯抑制，20%ALA濃度下作用更為明顯。其作用機(jī)制可能與①激光能量作用造成部分膠原分解；②光敏劑分解形成單線態(tài)氧的細(xì)胞毒作用，誘發(fā)成纖維細(xì)胞凋亡；③降低TGF-β1與α-SMA含量，調(diào)控減少瘢痕疙瘩表皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕成纖維細(xì)胞合成和胞外基質(zhì)沉積有關(guān)，但還需要開(kāi)展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。