豬產(chǎn)氣巴氏桿菌廣東株的分離鑒定及其16S rDNA 基因序列遺傳進(jìn)化分析

陳勝男，翟頎，李墾科，張杰，鐘汝情，陳曉倩，謝瑩，焦思思，冉承峰，翟少倫**，鄒育根**

（1.廣州中科基因檢測服務(wù)有限公司，廣州 510500；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640）

1974 年，美國科研人員從豬體內(nèi)分離到一種類產(chǎn)氣巴氏桿菌[1]。之后，這種細(xì)菌在加拿大、法國、捷克、比利時(shí)、丹麥、匈牙利、英格蘭等多個(gè)國家發(fā)現(xiàn)報(bào)道，由于其生化特征相似，都呈現(xiàn)氧化酶和尿素酶陽性，還可以分解多種糖類產(chǎn)氣，故而命名為產(chǎn)氣巴氏桿菌（Pasteurella aerogenes）[2-7]。分類學(xué)上，產(chǎn)氣巴氏桿菌是巴氏桿菌科（Pasteurella family）巴氏桿菌屬（Pasteurella genus）的成員。臨床上，多項(xiàng)研究表明其可與人和多種動(dòng)物的流產(chǎn)、死胎、脊椎炎等密切相關(guān)[8-12]。

本研究從廣東某豬場母豬產(chǎn)道分泌物中分離到一株革蘭氏陰性小球桿菌，經(jīng)16S rDNA 核苷酸序列比對分析鑒定為豬產(chǎn)氣巴氏桿菌，并對分離株的藥物敏感性、16S rDNA 遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析。具體報(bào)告如下：

1 病例描述

廣東某豬場存欄母豬350 頭，自2018 年6 月-11 月，一直出現(xiàn)母豬屢配不孕、流產(chǎn)等情況。為了弄清楚母豬繁殖障礙的原因，采集6 份母豬產(chǎn)道分泌物，待檢。

2 細(xì)菌分離

6 份母豬產(chǎn)道分泌物分別接種血平板，經(jīng)24 小時(shí)增菌培養(yǎng)，血平板上均出現(xiàn)1 種菌落，不溶血。經(jīng)革蘭氏染色，該菌呈現(xiàn)鏈狀的小球菌（圖1），命名為GD01 株。

3 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片法評估該菌的藥物敏感情況，結(jié)果顯示該菌對丁胺卡那霉素、恩諾沙星、阿莫西林克拉維酸鉀、羧芐西林和新霉素高度敏感，對氨芐西林、慶大霉素、多西環(huán)素、卡那霉素和妥布霉素中度敏感，對氟苯尼考、阿莫西林、青霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明低度敏感，而對林可霉素、大觀霉素、鏈霉素、磺胺異噁唑和甲氧芐氨嘧啶表現(xiàn)耐藥。

4 16S rDNA 序列擴(kuò)增、克隆與分析

采 用 細(xì) 菌 1 6 S r D N A 通 用 引 物 (F:5’-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3’; R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)組建PCR 擴(kuò)增16S rDNA 核酸序列，具體反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，30 個(gè)循環(huán)（95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s），72℃再延伸7min。經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳分析顯示，1%瓊脂糖凝膠出現(xiàn)約1500bp 大小的目的片段(圖2)。對片段進(jìn)行克隆測序，獲得1465bp 的核酸序列。在線Blastn 分析顯示GD01 株與我國云南的豬產(chǎn)氣巴氏桿菌菌株（ZY14013，GenBank 號：KM555273）同源性最高，達(dá)99.8%。由于GenBank 中產(chǎn)氣巴氏桿菌16S rDNA 核酸序列長短不一，本文截取了相同區(qū)域的序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示GD01 株與瑞士的豬源產(chǎn)氣巴氏桿菌（JF2011 株，GenBank 號：AF139577）同源性最高（99.9%），與美國的豬源產(chǎn)氣巴氏桿菌（P-172-71 株，GenBank 號：NR_026032）同源性最低（98.5%）（圖3）。在遺傳進(jìn)化樹上，也可看出GD01 株與產(chǎn)氣巴氏桿菌在同一分支，而與副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）332 株（GenBank號：AB370297）和麥?zhǔn)习褪蠗U菌（Pasteurella mairii）34310-72株（GenBank 號：AB370297）遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

5 討論與小結(jié)

2014 年，我國首例豬產(chǎn)氣巴氏桿菌感染病例是在云南省流產(chǎn)母豬群中報(bào)道，盡管分離株對小鼠有一定的致病性，豬樣品中豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬偽狂犬病毒、衣原體陰性，但其是否是引起豬流產(chǎn)的主要病原仍然未知[13]。本研究也在廣東流產(chǎn)豬群中，分離到豬產(chǎn)氣巴氏桿菌，所采集樣本中豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬偽狂犬病毒也是陰性。這進(jìn)一步驗(yàn)證了豬產(chǎn)氣巴氏桿菌是引起豬流產(chǎn)的重要潛在病原。亟需開展懷孕母豬群中的動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)，來評定其致病性。█