正畸力作用下鼠壓力側(cè)牙周組織中ATF4和RUNX2表達及意義

韓金友　張彬　陳保興　杭望雁

【摘要】 目的：探討ATF4和RUNX在鼠正畸牙移動過程中的表達變化及其作用。方法：將大鼠按正畸力作用時間分為0、3、6、12、24 h及3、5、7、14 d組，以右側(cè)上頜第一磨牙為實驗側(cè)，給予持續(xù)正畸力；左側(cè)第一磨牙為對照側(cè)不加力。采用RT-PCR、Western blot法和免疫組織化學(xué)法檢測ATF4及RUNX2 mRNA和蛋白的表達，HE染色觀察其細胞形態(tài)。結(jié)果：對照側(cè)牙周組織內(nèi)ATF4和RUNX2 mRNA水平有表達，其蛋白幾乎沒有表達。實驗側(cè)加力后蛋白表達增強并與牙齒移動時間相關(guān)。壓力區(qū)組織在12 h時ATF4和RUNX2表達量最高，24 h后組織中ATF4和RUNX2表達值開始下降；且實驗側(cè)ATF4和RUNX2表達量與對照側(cè)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：壓力可以誘導(dǎo)牙周組織中ATF4和RUNX2 mRNA和蛋白的短暫升高，兩者在正畸牙移動過程中的牙周組織改建和成骨過程中發(fā)揮作用。

【關(guān)鍵詞】 ATF4； RUNX2； 正畸牙移動； 牙周組織； 大鼠

轉(zhuǎn)錄活化因子4（activation transcription factor，ATF4）是新近發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)成骨細胞分化功能的轉(zhuǎn)錄因子，而RUNX2（runt-related transcription factor-2），是一個多功能轉(zhuǎn)錄因子，是第一個被證實的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子[1-2]。這些轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)特異的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對正畸力做出反應(yīng)，并引發(fā)一系列細胞生物學(xué)反應(yīng)。其主要是通過調(diào)節(jié)與骨形成相關(guān)的細胞分化和細胞外基質(zhì)蛋白的表達變化完成對骨骼發(fā)育的調(diào)控作用[3-4]。而轉(zhuǎn)錄因子與正畸牙周組織改建過程中機械信號傳導(dǎo)方面的研究鮮有報道[5-6]。本文用RT-PCR、免疫組織化學(xué)法和Western blot法分析了正畸力作用下RUNX2、ATF4H和蛋白在鼠壓力側(cè)牙周組織中的表達情況，探討了RUNX2和ATF4在正畸牙周組織改建中的作用、相互關(guān)系和相互調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量（220±10）g（山東大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（魯）20130001）。根據(jù)正畸力作用時間分為0、3、6、12、24 h及3、5、7、14 d組，右側(cè)上頜第一磨牙為實驗側(cè)，給予持續(xù)正畸力；另一側(cè)第一磨牙為對照側(cè)，不加力。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.1.2 主要試劑 RNA提取液Tizol試劑（Sigma公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Semi-quantitative RT-PCR）試劑盒和免疫組織化學(xué)檢測試劑（濟南翔科生物科技有限公司），兔抗大鼠ATF4多克隆抗體（北京博奧森生物試劑公司），RUNX2抗體（Bioworld Technology公司，美國），SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色盒（北京百浩生物科技有限公司），引物β-action由上海生工生物有限公司設(shè)計并合成。日本Olympus公司AUS 5400全自動生化分析儀，德國Heraeus高速冷凍離心機，上海富士膠片有限公司LAS-4000凝膠成像儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 牙移植模型的建立 所有實驗動物均定時、定量攝食，自由飲水。實驗動物上頜左側(cè)戴矯治器進行加力作為實驗側(cè)，上頜右側(cè)未戴矯治器作為對照側(cè)。喂養(yǎng)1周后，用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射（3 mL/kg）麻醉大鼠，然后用精細牙科高速車針在實驗動物左側(cè)上頜第一磨牙和雙側(cè)上頜切牙頸部磨溝深約0.5～1 mm然后將雙側(cè)上頜切牙連扎并在其與第一磨牙間放置鎳鈦螺簧以雙側(cè)上頜切牙為支抗，牽引左側(cè)上頜第一磨牙向近中移動力值為39 g，分別在戴矯治器后0、3、6、12、24 h和3、5、7、14 d用10%水合氯醛對大鼠進行麻醉并處死。

1.2.2 牙周組織標(biāo)本的制備 實驗完成處死動物后，取牙周膜新鮮組織塊，分出一部分組織進行RT-PCR和Western blot，其余組織用多聚甲醛進行固定，固定24 h，然后在4 oC下，進行脫鈣處理，并依次脫水和制備組織包埋切片。石蠟切片制備好后，用于后續(xù)實驗的病理學(xué)HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2.3 RT-PCR檢測ATF4和RUNX2 mRNA的表達 Trizol對細胞進行裂解并提取總RNA，采用Toyobo RT-PCR試劑盒進行一步擴增。并用beta-actin作為實驗內(nèi)參對照。ATF4上游引物和下游引物分別為5-CCCTCCACCTTCTTACAACC-3和5-TACGACTCTGGGCTCATAC-3。擴增產(chǎn)物片段為218 bp。RUNX2上游引物和下游引物分別為5-AGTGTGTGTGTCCGCATGAT-3和5-CCACTTGGGGTCTAAGAACG-3。擴增產(chǎn)物片段為232 bp。內(nèi)參beta-actin上游引物和下游引物分別為5-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3和5-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3。擴增產(chǎn)物片段大小為311 bp。上述引物有上海生工生物有限公司合成，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳后用凝膠成像系統(tǒng)成像并拍照。

1.2.4 Western blot檢測ATF4和RUNX2蛋白表達變化 組織細胞破裂后，進行核蛋白抽提，首先用PBS洗細胞，棄去清液后加入細胞裂解液，離心去除胞質(zhì)蛋白。核沉淀加入核蛋白裂解液，裂解充分后，高速離心4 ℃，12 000 g離心5 min，取上清分裝，為胞核蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆?。蛋白定量后，?00 ℃水浴5 min使蛋白變性，進行8% SDS-PAGE電泳。電泳后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相關(guān)蛋白一抗，于4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗滌膜3次，后加入相關(guān)蛋白二抗，于37 ℃孵育45 min，TBST洗滌3次后，在暗室中壓片、顯影、定影。圖像應(yīng)用Alpha Imager 2200軟件進行分析。endprint

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 于transwell板上室加入Matrigel膠（Becton Dickinson Company）與無血清培養(yǎng)基混合液，37 ℃，30 min，使Matrigel聚合成膠。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)A2780及LEC1細胞過夜，次日消化細胞，無血清培養(yǎng)基重懸細胞。每個transwell板上室加入100 μL細胞懸液（5×105個細胞），分別加入金雀異黃素聯(lián)合阿霉素藥物，終濃度為1、2、4 μg/mL，下室加入500 μL NIH3T3細胞無血清培養(yǎng)上清。培養(yǎng)72 h后，濕棉簽輕輕拭去聚碳酯膜和Matrigel凝膠表面的細胞。小心取出上室，甲醇固定30 min。蘇木素染色，脫水，切取碳酯膜于載玻片上中性樹脂封片，400倍高倍鏡下計數(shù)，取平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗及單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果顯示不同加壓時間點ATF4和RUNX2的mRNA表達變化 實驗側(cè)牙周膜組織中ATF4和RUNX2 mRNA水平有表達，加壓不同時間后，兩者的mRNA水平發(fā)生變化。在加壓后24 h達到表達最高值，其后表達下降，加力3 d后降至加力前水平。不同加壓時間點ATF4和RUNX2的mRNA表達變化見圖1。

2.2 Western blot檢測不同加壓時間點ATF4和RUNX2蛋白水平的表達變化 對照側(cè)牙周膜組織ATF4幾乎不表達，RUNX2表達水平很弱，加壓后的實驗側(cè)中蛋白水平開始升高，在24 h達到最高值，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1～2；加力24 h后，繼續(xù)增加作用時間，蛋白水平表達下降，加壓至14 d后，蛋白基本降至加壓前的水平。不同加壓時間點ATF4和RUNX2蛋白水平的表達變化見圖2。

圖1 不同加力時間點下ATF4和RUNX2的mRNA水平變化

注：1～9分別代表0、3、6、12、24 h和3、5、7、14 d組

圖2 不同加力時間點下ATF4和RUNX2蛋白表達變化

2.3 HE染色結(jié)果 光鏡下可見對照側(cè)牙周膜組織間隙均勻，其組織周圍纖維排列整齊，主纖維內(nèi)均勻分布著成纖維細胞。實驗側(cè)在加力3 h后即可見側(cè)牙周膜的間隙變窄小。加壓6、12 h和1 d后，側(cè)牙周膜組織間隙進一步變窄小，并伴隨成骨吸收陷窩的形成。在3、5、7 d后，牙槽骨表面繼續(xù)吸收陷窩并形成多個破骨細胞，發(fā)揮明顯的骨吸收作用；加壓14 d后，兩側(cè)側(cè)牙周膜組織寬度保持一致，并在牙周纖維處伴隨新牙骨的形成（圖3）。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 免疫組織化學(xué)顯示ATF4和RUNX2主要分布于細胞核，陽性細胞有棕黃色顆粒形成。在整個實驗過程中，不同加壓的實驗側(cè)牙周組織及其對照側(cè)中ATF4和RUNX2的表達變化如圖4所示。在正常對照組中，ATF4和RUNX2兩者呈弱陽性，免疫組織化學(xué)檢測其主要分布于牙周膜和牙齦成纖維細胞、成骨細胞及骨細胞胞漿中。加壓1 d后，陽性細胞個數(shù)最多，染色最強。其后，實驗側(cè)牙周膜ATF4和RUNX2陽性著色隨加力時間的延長而逐漸減弱，加力14 d時，ATF4和RUNX2的表達已明顯的減弱，但仍稍高于對照側(cè)。ATF4和RUNX2免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果見圖4。

3 討論

正畸過程中牙齒移動的基礎(chǔ)是機械力導(dǎo)致壓力側(cè)牙槽骨吸收，張力側(cè)牙槽骨形成。機械力刺激既可以誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)變化，又可以產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)，繼而誘導(dǎo)牙周組織的改建和重組[7-10]。牙周膜內(nèi)存在多種細胞，這些細胞在特定的機械信號傳導(dǎo)途徑下才具有向牙骨質(zhì)細胞和成骨細胞分化的可能。對牙周組織實施正畸壓力，誘導(dǎo)牙周膜細胞分化為成骨細胞，繼而參與骨吸收和骨形成，是正畸牙周組織骨改建的關(guān)鍵[11-12]。近十年的研究顯示，體外培養(yǎng)模擬正畸機械力刺激可誘導(dǎo)牙周膜細胞向成骨樣細胞分化，但如何把組織改建與機械信號轉(zhuǎn)化結(jié)合起來研究并應(yīng)用于臨床是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程，涉及到諸多的細胞因子、細胞外基質(zhì)蛋白以及信號通道[13-17]。

近年來，一些學(xué)者通過體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)骨形成轉(zhuǎn)錄因子RUNX2在間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[18]。Baumert等[19]發(fā)現(xiàn)在體外施加壓力的情況下，與成骨細胞分化和骨形成過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)，證明這些差異表達的基因在成骨細胞終末分化成熟過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控租用。正畸過程中，牙周組織受到外界機械力作用，將外界的力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生物信號，涉及諸多的生物學(xué)過程。一些研究認(rèn)為離子通路在這個過程中發(fā)揮作用，介導(dǎo)肌動蛋白的聚合并對力做出生物學(xué)反應(yīng)[20]。另外的研究認(rèn)為，細胞因子如前列腺素和白介素-1可以參與這個力學(xué)信號的傳導(dǎo)，進而與細胞內(nèi)外的各種蛋白和因子相互作用，形成更為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)通路，將外界力學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)樯飳W(xué)的組織重建過程[21-22]。

本文通過構(gòu)建相關(guān)的動物病理模型， 模擬臨床上患者的治療過程，驗證正畸力作用下大鼠的壓力側(cè)牙周組織中RUNX2和ATF4的表達水平的變化，并對兩者在表達水平上做定量分析，探討RUNX2和ATF4在鼠正畸牙移動過程中壓力側(cè)牙周組織中兩者的相互調(diào)控和互作關(guān)系。ATF4和RUNX在mRNA水平和蛋白水平的表達，實驗結(jié)果顯示在加力早期階段，牙周膜內(nèi)RUNX2和ATF4的表達隨時間逐漸增強。隨著時間的推移，牙周膜組織在外界加壓下，RUNX2和ATF4的蛋白表達降低，可能原因有：（1）首先RUNX2和ATF4兩者屬于同一個類型的蛋白功能單元，兩者具有相似的生物學(xué)功能，在生物學(xué)的發(fā)生過程中伴隨著兩者的協(xié)同作用，這種協(xié)同和互作的作用方式具有數(shù)個數(shù)量級的生物學(xué)效應(yīng)，在牙周組織的形成過程中發(fā)揮作用；（2）兩者在轉(zhuǎn)錄完成后，MAPK信號通路在機械力誘導(dǎo)的作用下使RUNX2發(fā)生磷酸化，RUNX2磷酸化后被激活并進入細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)下游作用原件并參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。另外，相關(guān)研究也證明RUNX2和OPG共同作用，對骨吸收具有抑制作用，并參與和調(diào)控骨形成與骨吸收的生物學(xué)過程。但其具體的發(fā)生機制尚未闡明，還需進一步相關(guān)的研究。endprint

綜上所述，在正畸牙移動過程中，筆者推測牙周組織的反應(yīng)是通過正畸力經(jīng)牙齒傳遞發(fā)生的。RUNX2和ATF4蛋白的表達變化引發(fā)牙周組織的重建，使牙齒的位置發(fā)生位移。本文的研究表明RUNX2和ATF4在牙周組織重建過程中起著重要的調(diào)控作用，是參與正畸牙移動和成骨關(guān)鍵通路，但其具體的作用機制有待進一步的研究和確認(rèn)。

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（收稿日期：2014-05-04） （本文編輯：蔡元元）endprint

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