清熱除濕止痛液的提取工藝研究

潘從澤 李喜香 董云霞 馮彥俊

基金項目：2015 年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項項目（項目編號：2015468001）。

作者簡介：潘從澤（1984-），男，漢族，碩士，中藥師，研究方向為中藥制劑的研究。E-mail：pancongze@163.com

通信作者：

【摘 要】 目的：優(yōu)選清熱除濕止痛液的提取工藝。方法：以龍膽苦苷含量為指標，采用L9（34）正交試驗來考察加水倍量、提取次數(shù)和提取時間對龍膽苦苷的影響。結(jié)果：最佳提取工藝為加水量8倍，提取3次，每次提取50min。結(jié)論：優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定、可行、重復(fù)性好，可作為清熱除濕止痛液的提取工藝。

【關(guān)鍵詞】 龍膽苦苷;提取工藝;正交試驗

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）7-0024-03

Study on the Extraction Technology of Qingre Chushi Zhitong Ye

PAN Congze1 LI Xixiang1 DONG Yunxia2 FENG Yanjun1

1 Gansu Provincial Hospital Of TCM，Lanzhou 730050，China;2 Pulmonary Hospital Of Lanzhou，Lanzhou 730050，China

Abstract：Objective To optimize the extraction process of Qingre Chushi Zhitong Ye. Methods Taking the content of gentiopicroside as the index，the L9 （34） orthogonal test was used to investigate the effect of water addition， extraction times and extraction time on Gentiopicroside. Results The best extraction process is 8 times of water addition， 3 times of extraction， 50 minutes each time. Conclusion The preferred extraction process is stable，feasible，and reproducible，and can be used as an extraction process for Qingre Chushi Zhitong Ye .

Keywords：Gentiopicroside;Extraction Process;Orthogonal Test

清熱除濕止痛液是甘肅省中醫(yī)院協(xié)定處方制劑，由秦艽、忍冬藤、防己等十味中藥組成，具有清熱除濕，通絡(luò)止痛的功效，用于治療風濕性、類風濕性關(guān)節(jié)炎、痛風性關(guān)節(jié)炎，強直性脊柱炎、肩周炎、頸椎病等屬風濕熱痹、出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛，局部紅腫灼熱等癥。歷經(jīng)多年臨床應(yīng)用效果明顯，可顯著改善風濕熱痹型膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛、活動受限、局部腫脹，發(fā)熱等局部和全身癥狀[1]?，F(xiàn)擬將傳統(tǒng)湯劑改為便于服用的合劑，對其提取工藝進行研究，轉(zhuǎn)化為醫(yī)院制劑，更好的為臨床服務(wù)。方藥中秦艽為祛風濕熱藥，指標成分為龍膽苦苷，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎等作用[2-4]。本實驗采用正交試驗，以龍膽苦苷為評判指標，對清熱除濕止痛液進行提取工藝優(yōu)化，找到最佳提取條件，對實際生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695型HPLC儀，Waters 2998型光電二極管陣列檢測器（美國Waters公司）;ABT100-5M電子天平（KERN德國）;MH-5000型可調(diào)式電熱套（武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司）;AKRY-UP-1816超純化水機（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）;RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SB-5200DTR超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料 秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材均購于蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院李喜香主任中藥師鑒定，符合2015版《中國藥典》藥材項下規(guī)定;龍膽苦苷對照品（批號110770-201716，中國食品藥品檢定研究院），甲醇為色譜純（批號20171204，天津市福晨化學試劑廠），其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定[4-7]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symm-etry-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇：水=30∶[KG-*3/5]70;流速1.0 mL/min;檢測波長：274 nm;柱溫：25 ℃。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以龍膽苦苷峰計應(yīng)不少于4000，分離度>1.5，龍膽苦苷對照品、清熱除濕止痛液供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品1.08 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取9份含秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材的混合飲片（78 g），按擬定的正交試驗設(shè)計進行水煎煮提取，濾過后濃縮至適量，加入乙醇，使含醇量達55%，靜置16小時，抽取上清液，回收乙醇至無醇味，加純化水至100 mL，得到清熱除濕止痛液。精密量取10 mL清熱除止痛液置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，微孔濾膜濾過，濾液即為供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按清熱除濕止痛液處方和制備工藝制備缺秦艽的陰性樣品，按“2.1.3”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.5 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件依次進樣，以進樣量（μL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。其線性回歸方程為：y=1727.83438x+15.00419，r=0.99994（n=5）線性范圍：0.52～4.16μg。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取“2.1.2” 項下對照品溶液10μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.3” 項下供試品溶液10μL，分別與放置在0、2、6、10、14、24h時進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.39%（n=6），表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗 按處方比例稱取處方藥材78g，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.71%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 按處方比例稱取秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材混合飲片39 g，平行9份，平均分為3組，每組分別按清熱除濕止痛液中龍膽苦苷含量的80%，100%，120%精密加入龍膽苦苷對照品，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，共9份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為99.48%，RSD=1.67%（n=9），表明該方法可行。結(jié)果見表1。

2.2 正交試驗 以提取時間（A）、加水倍量（B）、空白（C）及提取次數(shù)（D）為考察因素[8-9]，以龍膽苦苷含量為指標，按正交L9（34）進行試驗，因素水平、正交試驗設(shè)計及結(jié)果和方差分析分別見表2、表3和表4。

由極差分析結(jié)果可以得出，各因素對龍膽苦苷含量影響的大小順序為： A（提取時間）>B（加水倍量）>D（提取次數(shù)），其最佳工藝為A2B1D2。

由方差分析結(jié)果可知，提取時間（A）和加水倍量（B）差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），而提取次數(shù)（D）差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）?？紤]到藥材的提取效果，確定提取次數(shù)為3倍，得出最佳提取工藝為A2B1D3，即加水量8倍，提取3次，每次提取50min。

2.3 驗證試驗 按照最佳提取工藝A2B1D3分別提取三批處方量藥材進行驗證試驗，按照“2.1.3” 項下方法測定龍膽苦苷的含量，取平均值，結(jié)果優(yōu)于或近似于正交試驗的數(shù)據(jù)。驗證結(jié)果見表5。

3 討論

清熱除濕止痛液是由秦艽、忍冬藤、絡(luò)石藤、桑寄生、薏苡仁等10味中藥制成的復(fù)方制劑，其中秦艽為君藥，傳統(tǒng)用于風濕痹痛、筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛等病癥，廣泛用于風濕病的治療，在本院治療膝骨關(guān)節(jié)炎疾病的眾多案例中，取得了良好的臨床效果[1]。秦艽藥材中的主要成分以龍膽苦苷為主的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，而龍膽苦苷為其指標性成分[10]，選其為含量測定指標，且對清熱除止痛液質(zhì)量標準的進一步研究有一定的參考作用。

本實驗通過正交試驗設(shè)計對清熱除濕止痛液提取工藝進行優(yōu)化篩選，通過測定龍膽苦苷的含量來評價其內(nèi)在質(zhì)量，確定了最佳的提取工藝為加水量8倍，提取3次，每次提取50min，適合實際生產(chǎn)，可作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)和參考。

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（收稿日期：2019-02-13 編輯：程鵬飛）