DESI2基因干擾聯(lián)合PI3K抑制劑對(duì)人胰腺癌細(xì)胞ASPC-1的影響

歐希，張光濤，徐喆，陳景森，謝勇，劉吉奎，劉曉平

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 肝膽胰外科，廣東 深圳 518036；2.深圳市第三人民醫(yī)院 肝病三區(qū)，廣東 深圳518112；3.深圳市婦幼保健院 乳腺科，廣東 深圳 518028）

細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)病過(guò)程中（特別是在胰腺癌等惡性難治愈的腫瘤病變中）發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]，一旦細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制異?；蛘叩蛲鍪艿阶钄鄬?huì)導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)化[2]。系列研究表明，腫瘤細(xì)胞中多條通路可以導(dǎo)致細(xì)胞異常激活，阻斷細(xì)胞的正常凋亡過(guò)程，特別是AKT/mTOR信號(hào)通路，AKT蛋白中的T308和S473位發(fā)生磷酸化，會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與分化，從而使腫瘤細(xì)胞表達(dá)失調(diào)，造成細(xì)胞過(guò)度增殖[3]。因此一些與AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)的基因靶點(diǎn)藥物正在研發(fā)中，但是胰腺癌作為一種消化道高病死率的癌癥，單一的藥物或者基因阻斷不能很好地起到治療效果。為了避免胰腺癌這種治療抗拒，選擇聯(lián)合基因阻斷可以為增強(qiáng)胰腺癌治療效果提供新的途徑。人凋亡相關(guān)新基因DESI2（desumoylating isopeptidase 2，被人熟知的名稱是PNAS-4），是通過(guò)大規(guī)模測(cè)序獲得的一種新基因[4]，研究發(fā)現(xiàn)在肝癌和卵巢腫瘤中過(guò)表達(dá)DESI2基因都可以明顯觀察到腫瘤細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞活性明顯受到抑制[5-6]。還有報(bào)道表明，DESI2基因與AKT/mTOR信號(hào)通路有相互作用[7]，但是其作用機(jī)理暫無(wú)明確報(bào)道。因此在本實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建DESI2慢病毒干擾載體，并轉(zhuǎn)入相應(yīng)的胰腺癌細(xì)胞中，通過(guò)其與PI3K抑制劑聯(lián)合作用，觀察對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷效果。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及分組

ASPC-1細(xì)胞系購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。將ASPC-1細(xì)胞分為四組：（1）溶劑對(duì)照組；（2）PI3K抑制劑組；（3）DESI2干擾+PI3K抑制劑組；（4）DESI2空載+PI3K抑制劑組。各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞使用Opti-MEM?培養(yǎng)基稀釋DNA，制備DNA預(yù)混液，然后添加P3000TM試劑充分混勻，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

Lipofectamine?3000（18882752，Invitrogen）；OPTI-MEM?I（331985-062，Gibco）；Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒（CW0581M，康為世紀(jì)）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（CW2569M，康為世紀(jì)）；Ul traSYBR Mixture（CW0957M，康為世紀(jì)）；Fluo 4-AM（F312，Dojindo）；超敏發(fā)光液（RJ239676，賽默飛）；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金橋，1/2000）；Rabbit Polyclonal Anti-AKT（bs-2720R，Bioss，1/1500）；Rabbit Polyclonal Anti-P-AKT（bs-0876R，Bioss，1/1500）；Rabbit Monoclonal Anti-MTOR（ab32028，Abcam，1/1000）；Rabbit Polyclonal Anti-P-MOTR（Ser2448，Cell Signalingr，1/1000）；Rabbit Polyclonal Anti-PI3K（bs-2067R，Bioss，1/1500）；Rabbit Polyclonal Anti-P-PI3K（Tyr458，Cell Signalingr，1/1000）； Mouse Monoclonal Anti-Caspase3（bsm-33199M，Bioss，1/1000）；Rabbit Polyclonal Anti-DESI2（bs-19976R，Bioss，1/1000）；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES聯(lián)科生物）；Cell Cycle Staining Kit（CCS012，MULTI SCIENCES聯(lián)科生物）；熒光細(xì)胞成像儀（ZOETM Bio-Rad）；蛋白垂直電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠），超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTM XRS+，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]；熒光PCR儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，CFX ConnectTM實(shí)時(shí)]；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀[NovoCyte 2060R，艾森生物（杭州）有限公司]。

1.3 DESI2干擾載體的構(gòu)建

NCBI查找DESI2的基因，根據(jù)其基因的CDS序列設(shè)計(jì)shRNA靶序列，正義鏈引入BamHI酶切位點(diǎn)，反義鏈引入EcoRI酶切位點(diǎn)，退火形成雙鏈，與載體pGreenpuro連接，構(gòu)建慢病毒重組載體sh-DESI2-pGreenpuro。見(jiàn)表1。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用MTT法。將5×MTT用Dilution Buffer稀釋成1×MTT，每孔加50 μL 1×MTT，在37 ℃孵育4 h，使MTT還原為甲臢，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO使甲臢溶解，用酶標(biāo)儀慢速振蕩搖勻；酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度。

表1 sh-DESI2序列

1.5 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化1 min，加入含10%FBS的DMEM，將細(xì)胞吹打下來(lái)并吸取到1.50 mL離心管中，離心，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次（2 000 r/min離心5 min），收集1×105～5×105細(xì)胞，再加入1 mL 70%的乙醇溶液，放入4 ℃條件下2 h進(jìn)行細(xì)胞固定。每管加PBS 1 mL，混勻，8 000 r/min離心3 min，棄上清。加入1 mL DNA staining solution，渦旋振蕩5～10 s混勻。室溫避光孵育30 min。上機(jī)檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析。

收集1×106～3×106個(gè)細(xì)胞，加1 mL PBS 1 500 r/min離心，3 min，洗兩遍。用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer。取300 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。每管各加入3 μL Annexin V-FITC和5 μL PI-PE。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer?；靹蚝笊狭魇郊?xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞種板前1 d，血清饑餓12 h，常規(guī)消化、離心收集細(xì)胞，用低血清DMEM培養(yǎng)液（含0.2% FBS）混懸成密度為5×105/mL的單細(xì)胞懸液。將Transwell培養(yǎng)池放入24孔培養(yǎng)板中，上室內(nèi)加入100 μL細(xì)胞懸液（約5×104細(xì)胞），下室內(nèi)加入500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。置于5% CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室內(nèi)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20～30 min，PBS洗2次，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗2次，去掉多余染料，顯微鏡下觀察拍照。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)各基因的mRNA表達(dá)情況

取各組細(xì)胞進(jìn)行RNA的提取，提取RNA后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，算出各組細(xì)胞中DESI2、AKT、Caspase3、mTOR和PI3K的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.8 Western blotting檢測(cè)各蛋白表達(dá)情況

取各組細(xì)胞加入組織裂解液，裂解30 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，再進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。4 ℃孵育一抗過(guò)夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1DESI2干擾載體的鑒定及效果驗(yàn)證

慢病毒重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，給予菌落PCR驗(yàn)證，理論上會(huì)得到629 bp大小的條帶，由圖1可知，電泳結(jié)果與理論值相符，均有陽(yáng)性點(diǎn)。利用熒光定量PCR方法檢測(cè)三條干擾序列中最具有干擾效果的序列，如圖2A所示，三條干擾序列中sh-DESI2(3)具有干擾效果，因此選擇sh-DESI2(3)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。如圖2B所示，與對(duì)照組相比，DESI2空載組的DESI2表達(dá)明顯升高，DESI2干擾組則明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞增殖情況

如圖3所示，與對(duì)照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組，細(xì)胞的增殖受到抑制；與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細(xì)胞活性明顯升高。

圖1 菌落PCR電泳圖

圖2 DESI2干擾載體效果的驗(yàn)證

2.3 各組細(xì)胞周期變化情況

如圖4所示，與對(duì)照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組細(xì)胞活性明顯下降，G1期比例升高，S期和G2期比例降低。與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細(xì)胞活性明顯升高，G1期比例降低，S期比例升高。與對(duì)照組相比，PI3K抑制劑處理ASPC-1細(xì)胞可以抑制細(xì)胞增殖；而PI3K抑制劑處理DESI2干擾的ASPC-1細(xì)胞可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。

2.4 各組細(xì)胞凋亡情況

圖3 MTT檢測(cè)結(jié)果

如圖5所示，與對(duì)照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組的凋亡明顯升高；與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細(xì)胞的凋亡明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞侵襲情況

如圖6所示，與對(duì)照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組的細(xì)胞侵襲明顯下降；與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細(xì)胞侵襲明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 各組細(xì)胞中的DESI2、AKT、PI3K、mTOR、Caspase3 mRNA和蛋白的表達(dá)結(jié)果以及p-AKT、p-PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)結(jié)果

與對(duì)照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組Caspase3 mRNA和蛋白表達(dá)升高，AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的蛋白表達(dá)量明顯下降；與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組Caspase3 mRNA和蛋白表達(dá)下降，AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的蛋白表達(dá)量明顯升高。見(jiàn)圖7。

3 討論

圖4 各組細(xì)胞周期變化

基因靶向藥物是腫瘤最新的治療方式，靶點(diǎn)的選擇和抗藥性是其中的難點(diǎn)也是胰腺癌難以治療和根治的主要原因之一[8]。如何解決藥物的耐藥性以及提高治療的有效性是人們當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。2002年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院在大規(guī)模測(cè)序中鑒定出一種新基因：DESI2基因，它定位于人染色體1q44，并且有5個(gè)外顯子，可以編碼1個(gè)由194個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白[9]。DESI2基因是一種促凋亡基因，有研究表明，DESI2不僅與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，并且還參與了多種腫瘤的生物學(xué)行為[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，DESI2基因在結(jié)直腸癌、肺癌等腫瘤中的表達(dá)均明顯下降，可能DESI2基因在多種腫瘤中起著抑制腫瘤發(fā)生的作用[11-12]。AKT/mTOR是經(jīng)典的信號(hào)通路之一，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化調(diào)節(jié)等各方面[13]。研究發(fā)現(xiàn)，活化的PI3K可以使AKT磷酸化而生成p-AKT，p-AKT進(jìn)一步磷酸化其下游的酪氨酸和色氨酸殘基，從而激活下游因子，抑制胰腺癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期的運(yùn)行，增加腫瘤血管形成和侵襲、轉(zhuǎn)移的效果[14-17]，因此通過(guò)采用PI3K抑制劑可以有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡通路的開(kāi)啟，其作用機(jī)理可能是通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞中Caspase3蛋白的生成從而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程[18]，本研究與其結(jié)果類似，但是單一的抑制劑效果有限，因此需要尋找其相互作用的基因進(jìn)一步來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡以達(dá)到腫瘤治療的效果和效率。

圖5 各組細(xì)胞凋亡變化

在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組細(xì)胞活性明顯下降，G1期比例升高，S期和G2期比例降低，凋亡明顯升高，細(xì)胞侵襲能力明顯下降，DESI2和Caspase3的表達(dá)明顯升高，AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的表達(dá)量明顯下降。與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細(xì)胞活性明顯升高，G1期比例降低，S期比例升高，凋亡明顯下降，細(xì)胞侵襲能力明顯升高，DESI2和Caspase3的表達(dá)明顯下降，AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的表達(dá)量明顯升高。這表明PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的功能狀態(tài)能反饋調(diào)節(jié)上游DESI2基因的表達(dá)。得到這一結(jié)論的可能原因有以下幾個(gè)方面：第一，單獨(dú)的PI3K抑制劑可以明顯達(dá)到抗腫瘤的效果，但是聯(lián)合DESI2干擾后這一效果明顯受到影響；第二，DESI2基因與PI3K/AKT/mTOR通路可以同時(shí)影響Caspase3蛋白的生成，因此兩者之間可能有共同的凋亡途徑，加入DESI2干擾后明顯影響了腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程；第三，通過(guò)體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)PI3K抑制劑處理后ASPC-1細(xì)胞的生存能力明顯降低、侵襲能力明顯減弱以及凋亡明顯增加，但是加入DESI2干擾后這些效果明顯受到影響；第四，通過(guò)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入DESI2干擾后AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的表達(dá)量明顯升高，而這些蛋白表達(dá)量的改變將進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

總之，胰腺癌的細(xì)胞凋亡過(guò)程與AKT/mTOR及DESI2蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，抑制DESI2蛋白的表達(dá)可能激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。因此本課題組下一步將繼續(xù)對(duì)聯(lián)合使用DESI2過(guò)表達(dá)載體與PI3K抑制劑進(jìn)行研究，希望能為進(jìn)一步提高胰腺腫瘤的治療效果提供新的思路。

圖6 各組細(xì)胞侵襲結(jié)果

圖7 各組細(xì)胞中的DESI2、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、p-mTOR、mTOR、Caspase3表達(dá)結(jié)果