GINS 2蛋白在宮頸癌組織中的表達情況及其與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

王媛，惠雙，張成輝，郭宏強，賀海發(fā)，楊如玉

南陽市中心醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，3病理科，4南陽市血液腫瘤實驗室，河南南陽 473000

2鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，鄭州 450008

宮頸癌是全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題，其進展緩慢、轉(zhuǎn)移晚，臨床癥狀顯著，嚴重威脅女性患者的健康和生命。多數(shù)患者就診時的病灶相對局限，且預(yù)后較差，5年生存率較低[1-4]，因此，深入探討宮頸癌的發(fā)病機制對于宮頸癌的早期診斷、早期治療以及宮頸癌患者生存質(zhì)量的提高均具有重要的意義。GINS2蛋白（GINS complex subunit 2，GINS2）是含有兩個Ca2+EF-hand域和一個亮氨酸/異亮氨酸富集區(qū)的多功能蛋白，在多種外周組織中正常表達，在下丘腦核中表達并參與能量平衡等生物過程；此外，其配體在胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)調(diào)控、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用[5]，GINS2參與了胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、免疫和病毒感染等一系列生理活動[6-7]。目前，關(guān)于GINS2的研究主要集中在肺癌、乳腺癌方面，而關(guān)于GINS2表達與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究較少。因此，本研究通過探討宮頸癌組織中GINS2蛋白的表達與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為宮頸癌患者的早期診斷和治療提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本選取

選取2011年3月至2015年1月南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科確診的98例宮頸癌患者的宮頸癌組織作為觀察組。宮頸癌患者的納入標準：①初中以上文化水平，且年齡≥18歲；②無精神障礙史，可自由交流和溝通；③接受化療≥2個療程；④均行血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、宮頸病理組織檢查。排除標準：①存在心源性休克和永久性心臟內(nèi)傳導紊亂；②合并嚴重精神類疾??；③治療期間，同步接受其他腫瘤的化療；④存在其他嚴重疾病。98例宮頸癌患者的年齡為48～67歲，平均年齡為（57.5±4.8）歲；體重為50～63 kg,平均體重為（56.1±4.1）歲；HPV陽性65例，HPV陰性33例。采用2012年版國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標準[8]進行病理分期：Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期46例；病理類型：鱗癌85例，腺癌13例。選取同期24例健康體檢者的正常宮頸組織作為對照組。健康體檢者的年齡為50～68歲，平均年齡為（59.2±4.0）歲；體重為50～61 kg，平均體重為（55.3±3.1）kg。兩組受試者的年齡和體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。全部患者及家屬均對本研究知情同意并自愿簽署知情同意書，且本研究經(jīng)過南陽市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審批通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 GINS 2蛋白相對表達量的檢測分別稱取0.1 g正常宮頸組織和宮頸癌組織，采用微波粉碎器將宮頸組織碾磨成粉末狀，將其轉(zhuǎn)入2 ml無菌管中，加入1.5 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（pH 7.4），充分振蕩混勻，4 ℃靜止2 h，以4500 r/min離心20 min，離心半徑為5 cm，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunoadsordent assay，ELISA）試劑盒（購于上海恒遠生物科技有限公司）檢測GINS2蛋白的相對表達量。

1.2.2 GINS 2蛋白陽性表達情況檢測及結(jié)果判定采用免疫組織化學染色法檢測GINS2蛋白在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達情況。制作常規(guī)5 μm厚的石蠟切片，3%過氧化氫溶液常溫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，微波修復抗原，PBS常規(guī)沖洗，1%GINS2抗體工作液（購于英國Abcam公司），4 ℃過夜，加入二抗IgG（稀釋濃度為1∶1000），室溫孵育30 min，加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，蘇木素復染，乙醇梯度水化，封片。每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），采用雙盲法評估GINS2蛋白的陽性表達情況。GINS2蛋白陽性表達定位于細胞核。根據(jù)染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽性細胞所占百分比評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分；兩種評分相加，最終結(jié)果0～1分為陰性（-）；2分為弱陽性（+）；3～4分為強陽性（++）；5～7分為極強陽性（+++）。本研究將陰性和弱陽性歸為陰性表達，強陽性和極強陽性歸為陽性表達。

1.3 觀察指標及隨訪

比較宮頸癌組織和正常宮頸組織中GINS2蛋白的表達情況，分析GINS2蛋白表達與宮頸癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。采用電話隨訪的方式對宮頸癌患者的生存情況進行隨訪，隨訪起始日期為術(shù)后第1天，隨訪截止日期為2018年1月1日。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Epidata錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GINS 2蛋白的表達情況

宮頸癌組織中GINS2蛋白的相對表達量為（2.28±0.15）ng/g，明顯高于正常宮頸組織的（0.78±0.12）ng/g，差異有統(tǒng)計學意義（t=45.506，P＜0.01）。宮頸癌組織中GINS2蛋白的陽性表達率為79.6%（78/98），明顯高于正常宮頸組織的4.2%（1/24），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=63.186，P＜0.01）（圖1）。

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中GINS 2蛋白的表達情況

圖1 宮頸癌組織（n=98）和正常宮頸組織（n=24）中GINS 2蛋白的陽性表達情況（二氨基聯(lián)苯胺法染色，×400）

不同年齡宮頸癌患者宮頸癌組織中GINS2蛋白的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同病理類型、組織分化程度、TMN分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況宮頸癌患者宮頸癌組織中GINS2蛋白的陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者GINS 2蛋白的表達情況（n=98）

2.3 宮頸癌組織中GINS 2蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系

截至隨訪結(jié)束，宮頸癌組織中GINS2蛋白陽性表達患者失訪18例，死亡44例；GINS2蛋白陰性表達患者失訪5例，死亡1例。GINS2蛋白陰性表達患者的3年生存率為70.0%（14/20），高于GINS2陽性表達患者的20.5%（16/78），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.206，P＜0.05）。GINS2蛋白陰性表達患者的生存期為（27.5±5.98）個月，長于GINS2蛋白陽性表達患者的（13.8±6.43）個月，差異有統(tǒng)計學意義（t=20.369，P＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率逐年遞增。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中GINS2蛋白的相對表達量明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01），說明GINS2蛋白在宮頸癌組織中的表達水平較高。國外研究顯示，GINS2蛋白對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的調(diào)控作用，其具有時間、空間表達的特異性；若藥物沉默GINS2蛋白表達，腫瘤細胞的生長能得到有效的抑制[5,7,9]。結(jié)合本次研究結(jié)果，提示GINS2蛋白可能成為宮頸癌治療的分子靶點。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中GINS2蛋白的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01）。不同病理分型、組織分化程度、TMN分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況宮頸癌患者的宮頸癌組織比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明高表達的GINS2蛋白能夠促進宮頸癌的進展。GINS2蛋白在對啟動細胞的增殖具有重要的作用，并能抑制細胞的凋亡[10]。高表達GINS2蛋白的腫瘤細胞黏附內(nèi)皮細胞的能力更強，而腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞僅有緊密結(jié)合才能夠穿過細胞外基質(zhì)層，建立轉(zhuǎn)移灶GINS2蛋白可介導細胞的定向轉(zhuǎn)移和趨化性，并激活淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、中性粒細胞、上皮細胞上相應(yīng)的趨化因子受體，因此，高表達GINS2蛋白的腫瘤細胞在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。這與本研究結(jié)果中GINS2蛋白能夠促進宮頸癌的進展的結(jié)果相符合。本研究中，GINS2蛋白陰性表達患者的3年生存率高于GINS2陽性表達患者，3年生存期長于GINS2蛋白陽性表達患者（P＜0.05），提示GINS2低表達能夠抑制腫瘤的發(fā)展，使患者獲得較好的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，GINS2能夠調(diào)控BAX/Blc的表達水平，從而對細胞凋亡起到調(diào)控作用，具體表現(xiàn)為誘導Bcl-2高表達，形成異源二聚體BAX/BAX，從而抑制細胞凋亡[10]。

綜上所述，GINS2蛋白在宮頸癌組織中的相對表達量和陽性表達率均較高，其在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起促進作用；GINS2蛋白低表達的宮頸癌患者能夠獲得較好的預(yù)后。由于本研究納入的樣本量較少，因此不可避免地存在選擇偏倚，在本研究的下個階段將擴大樣本量，并通過細胞實驗進一步探討GINS2蛋白與宮頸癌發(fā)病機制的關(guān)系。