DAB 2IP和 β-catenin在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

宋志明，高明，王穎霞，申麗娟

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院1康復(fù)醫(yī)學(xué)科，2腫瘤科，鄭州 450052

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)中國癌癥流行病學(xué)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，盡管中國胃癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但由于中國的人口基數(shù)龐大，且老齡化速度加快，胃癌仍是僅次于肺癌的具有高發(fā)病率和高病死率的惡性腫瘤[1]。胃癌的起病較為隱匿，當(dāng)胃癌患者出現(xiàn)疼痛、惡心、嘔吐和消瘦等臨床癥狀時(shí)常已進(jìn)展至中晚期。既往研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生、發(fā)展受多基因、多因子的調(diào)控，但目前仍缺乏被廣泛認(rèn)可的特異性腫瘤標(biāo)志物，因此，尋找快速、有效的胃癌診斷和預(yù)后評(píng)估生物學(xué)指標(biāo)是目前的研究熱點(diǎn)[2]。人DAB2相互作用蛋白（disabled homolog 2-interacting protein，DAB2IP）是Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白（Ras guanosine triphosphatase activating protein，Ras-GAP）家族的成員之一，能夠通過介導(dǎo)多種信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的周期，并抑制腫瘤的生長、分化及新血管的生成[3]。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是上皮鈣黏素-連環(huán)素復(fù)合體的重要組成部分，具有細(xì)胞黏附和識(shí)別的雙重功能，是WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，在WNT靶基因介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、分化及腫瘤的浸潤和侵襲過程中發(fā)揮著重要的作用[4]。Xie等[5]進(jìn)行了關(guān)于前列腺癌的研究，發(fā)現(xiàn)DAB2IP可通過調(diào)節(jié)糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）-β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。朱鵬武等[6]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中DAB2IP和β-catenin的異常表達(dá)與胃癌的臨床分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。但目前關(guān)于DAB2IP和β-catenin在胃癌組織表達(dá)的相關(guān)性及與患者臨床特征的關(guān)系仍鮮有報(bào)道。基于以上研究背景，本研究擬對(duì)行胃癌根治術(shù)的95例患者的術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行DAB2IP和β-catenin陽性率的檢測，旨在分析DAB2IP和β-catenin在胃癌患者胃癌組織中的陽性表達(dá)情況及其對(duì)患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值，為進(jìn)一步探索二者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的潛在分子學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取

選取2008年7月至2012年9月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療的胃癌患者95例，留取其胃癌切除新鮮組織標(biāo)本。95例胃癌患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①行胃癌根治術(shù)；②經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為胃癌；③術(shù)前未行放療、化療、生物免疫治療或靶向治療；④既往無其他部位的腫瘤病史；⑤具備一定的聽、說、讀、寫能力。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的心肝腎功能不全；②合并精神或認(rèn)知功能障礙。95例胃癌患者中，男53例，女42例；年齡為34～79歲，平均年齡為（54.26±16.40）歲；組織學(xué)分化程度參照2000年世界衛(wèi)生組織（WHO）分類標(biāo)準(zhǔn)[7]：低分化53例，中高分化42例；TNM分期參照2002年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（Union for International Cancer Control/American Joint Committee on Cancer，UICC/AJCC）指南[8]：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期52例。另選取同期30例胃癌患者（均隨機(jī)從95例胃癌患者的胃癌組織中選?。┫鄳?yīng)的癌旁正常黏膜組織（距腫瘤邊緣5 cm以上），均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為正常的胃黏膜組織。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

所有標(biāo)本均先采用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水和石蠟包埋后，4 μm厚連續(xù)切片，并行常規(guī)蘇木精-伊紅染色和病理學(xué)檢查。具體染色方法：選取8張石蠟切片進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)，然后分別采用3%H2O2和正常動(dòng)物血清封閉50 min，封閉結(jié)束后，將其中4張切片滴入兔抗人DAB2IP單克隆抗體（稀釋濃度1∶100，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司），4℃下孵育24 h；另外4張組織切片滴入鼠抗人β-catenin抗體（稀釋濃度1∶50，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），4℃下孵育24 h；孵育完成后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃下孵育40 min后，PBS連續(xù)沖洗3次（＞5 min）；滴加鏈霉卵白素和辣根酶標(biāo)記生物素復(fù)合物，37℃下孵育40 min后，PBS連續(xù)沖洗3次（＞5 min）；滴加氨基聯(lián)苯氮顯色液，常溫下顯色3～5 min，并用PBS替代一抗體作為陰性對(duì)照。

1.3 染色結(jié)果判定

DAB2IP陽性染色為主要定位于細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒；β-catenin陽性染色主要定位于細(xì)胞膜，出現(xiàn)棕褐色細(xì)小顆粒狀。每張石蠟切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞；采用半定量乘積法對(duì)染色結(jié)果計(jì)分。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：＜6%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75為4分。最終按照兩項(xiàng)的乘積計(jì)算總分，總分≥3分為陽性，總分≤2分為陰性。

1.4 隨訪

主要采用微信群、電話和電子郵件的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，定期與患者預(yù)約門診復(fù)查的時(shí)間。從患者進(jìn)行胃癌根治術(shù)為事件的起點(diǎn)，以隨訪中患者死亡或不明原因的失訪為終點(diǎn)事件。隨訪截止時(shí)間為2017年8月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將實(shí)驗(yàn)室和隨訪數(shù)據(jù)錄入Epidata 3.0軟件建立胃癌數(shù)據(jù)庫，并采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用 McNemarχ2檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析；生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，生存時(shí)間的比較采用Breslow檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響因素進(jìn)行單因素和多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAB 2IP和 β-catenin陽性表達(dá)情況的比較

β-catenin在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為64.21%，明顯高于癌旁正常黏膜組織的36.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.083，P＜0.01）；DAB2IP在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為49.47%，明顯低于癌旁正常黏膜組織的93.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.493，P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中DAB 2IP和 β-catenin陽性表達(dá)情況的比較 [n（%）]

2.2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中DAB 2IP和 β-catenin陽性表達(dá)情況的比較

不同TNM分期、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胃癌患者胃癌組織中DAB2IP陽性表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.943、8.255、6.281、11.533，P＜0.05）；不同年齡、性別、腫瘤最大徑、組織分化程度胃癌患者胃癌組織中DAB2IP的陽性表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度和浸潤深度胃癌患者胃癌組織中β-catenin的陽性表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.820、7.224、11.043、8.119，P＜0.05）；不同年齡、性別、腫瘤最大徑和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況胃癌患者胃癌組織中β-catenin的陽性表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 94例胃癌患者預(yù)后的影響因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，DAB2IP表達(dá)（HR=0.35，95%CI：0.19～0.67）、年齡（HR=2.44，95%CI：1.15～5.14）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（HR=3.25，95%CI：1.05～10.10）、TNM分期（HR=2.35，95%CI：1.02～5.39）和β-catenin表達(dá)（HR=2.21，95%CI：1.20～4.10）可能與胃癌患者的預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）（表3）。將上述5種有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素再次納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和DAB2IP陰性表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.01）（表4）。

2.4 胃癌組織中DAB 2IP和 β-catenin表達(dá)的相關(guān)性

47例DAB2IP陽性表達(dá)的胃癌患者的胃癌組織中，β-catenin的陽性表達(dá)率為38.30%（18/47）；48例DAB2IP陰性表達(dá)的胃癌患者的胃癌組織中，βcatenin的陽性表達(dá)率為89.58%（43/48）。β-catenin在DAB2IP陰性表達(dá)組織中的陽性表達(dá)率明顯高于DAB2IP陽性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，DAB2IP和β-catenin在胃癌組織中的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.535，P＜0.01）。（表5）

表2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中DAB 2IP和 β-catenin的陽性表達(dá)情況

表3 胃癌患者預(yù)后影響因素的單因素COX回歸分析

表4 胃癌患者預(yù)后影響因素的多因素COX回歸分析

表5 胃癌組織中DAB 2IP和 β-catenin表達(dá)的相關(guān)性（n=95）

2.5 DAB 2IP和 β-catenin表達(dá)與胃癌患者生存情況的關(guān)系

95例胃癌患者的中位隨訪時(shí)間為38個(gè)月（9～60個(gè)月）。47例DAB2IP陽性表達(dá)的患者中，12例（25.53%）患者死亡；48例DAB2IP陰性表達(dá)的患者中，23例（47.92%）患者死亡。DAB2IP陽性表達(dá)患者的生存時(shí)間為12～60個(gè)月，長于DAB2IP陰性表達(dá)患者的9～60個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.991，P=0.025）（圖1）。61例β-catenin 陽性表達(dá)的患者中，28例（45.90%）患者死亡；34例β-catenin陰性表達(dá)的患者中，7例（20.59%）患者死亡。β-catenin陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間為9～60個(gè)月，長于陽性表達(dá)組患者的12～52個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.556，P=0.033）（圖2）。

圖1 DAB 2IP陽性表達(dá)（n=47）和DAB 2IP陰性表達(dá)（n=48）胃癌患者的生存曲線

圖2 β-catenin陽性表達(dá)（n=61）和 β-catenin陰性表達(dá)（n=34）胃癌患者的生存曲線

3 討論

DAB2IP又稱ASK1相互作用蛋白，是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌基因，其定位于染色體9q33.1～q33.3上，由C2、RasGAP、PH和DUF四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，共包含14個(gè)內(nèi)含子和15個(gè)外顯子，可編碼967個(gè)氨基酸[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，DAB2IP能夠抑制前列腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并參與多種腫瘤相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的核心環(huán)節(jié)[3,5-6]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，DAB2IP能夠介導(dǎo)MAER/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）-c-Jun氨基末端激酶1（c-jun N-terminal kinase 1，JNK1）通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路、磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）通路及GSK-3β-β-catenin通路等參與細(xì)胞的生長、分化和凋亡[10-11]。研究證實(shí)，DAB2IP在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)均下調(diào)。Dote等[12]研究認(rèn)為，胃腸道腫瘤中DAB2IP表達(dá)的下調(diào)主要與啟動(dòng)子5′區(qū)域的異常甲基化有關(guān)，且啟動(dòng)子m2a和m2b區(qū)域的甲基化狀態(tài)與胃部腫瘤的發(fā)病位置有關(guān)。目前，關(guān)于DAB2IP在胃癌組織中表達(dá)情況及其與患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道仍較少見。本研究結(jié)果顯示，DAB2IP在胃癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常黏膜組織（P＜0.01）。這與王瀚等[13]研究的結(jié)果相似，其分析認(rèn)為主要與胃癌組織中的DAB2IP表達(dá)受到抑制有關(guān)。另外，不同TNM分期、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胃癌患者胃癌組織中DAB2IP表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且隨著TNM分期、浸潤深度的增加，陽性表達(dá)率降低。DAB2IP陽性表達(dá)與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的研究結(jié)果顯示，DAB2IP陽性表達(dá)患者的生存時(shí)間長于DAB2IP陰性表達(dá)患者（P＜0.05）。Cox回歸分析顯示，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和DAB2IP陰性表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。上述結(jié)果均提示DAB2IP對(duì)胃癌患者的診斷和預(yù)后預(yù)測具有重要的價(jià)值，有望成為今后胃癌患者療效和預(yù)后評(píng)估的重要參考指標(biāo)。

β-catenin是一種主要存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中的單鏈多肽，主要由CTNNBl基因編碼，通常被認(rèn)為是WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要組成部分[14]。在正常生理情況下，β-catenin主要被腫瘤抑制基因APC抑制而維持低水平狀態(tài)。WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活或APC的突變可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)βcatenin大量積聚。既往相關(guān)研究表明，WNT/βcatenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過調(diào)控多種效應(yīng)分子從而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程[4,15]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中β-catenin的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常黏膜組織（P＜0.01），且不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度和浸潤深度胃癌患者胃癌組織中β-catenin表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與Kaya等[16]以及陳超和姚莉敏[17]的研究結(jié)果相似。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間長于β-cateni陽性表達(dá)（P＜0.05）；單因素回歸分析結(jié)果顯示，βcatenin表達(dá)可能是胃癌患者預(yù)后的影響因素（HR=2.21，95%CI：1.20～4.10），上述結(jié)果均提示β-catenin也參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后過程。但是，多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)β-catenin表達(dá)不是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＞0.05），因此，關(guān)于β-catenin與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

目前，關(guān)于DAB2IP與β-catenin之間相互作用方式的研究仍較少。Xie等[5]進(jìn)行的一項(xiàng)關(guān)于前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DAB2IP正常表達(dá)時(shí)，其分子結(jié)構(gòu)中的C2結(jié)構(gòu)域可與蛋白磷酸酶2A和GSK-3β相結(jié)合，誘導(dǎo)GSK-3β活化進(jìn)而導(dǎo)致β-catenin表達(dá)下調(diào)，主要表現(xiàn)為GSK-3β-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的阻斷。而前列腺癌細(xì)胞中DAB2IP沉默導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)時(shí)，β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，導(dǎo)致過多的β-catenin積聚在細(xì)胞核內(nèi)，加速其在細(xì)胞質(zhì)中的降解進(jìn)程，誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力。Wu等[18]同樣研究發(fā)現(xiàn)，DAB2IP能夠阻斷WNT/β-catenin通路，誘導(dǎo)抗凋亡因子Clusterin表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞的抗藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中DAB2IP的陽性表達(dá)率低于癌旁正常黏膜組織，而β-catenin的陽性表達(dá)率高于癌旁正常黏膜組織（P＜0.05）。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，二者在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.535，P＜0.01），這可能提示DAB2IP也可通過GSK-3β-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用。

綜上所述，DAB2IP和β-catenin可作為胃癌診斷和預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)。兩者在胃癌組織中的異常表達(dá)與胃癌患者的TNM分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況和生存時(shí)間密切相關(guān)，且隨著兩者分子生物學(xué)交互作用的進(jìn)一步闡明，可能為評(píng)估胃癌的生物學(xué)行為提供更多的標(biāo)志物。當(dāng)然，本研究仍存在不足之處，主要是納入的樣本量較小和隨機(jī)誤差的影響較大。因此，未來研究應(yīng)進(jìn)一步納入更多的胃癌患者并進(jìn)行遠(yuǎn)期生存情況的隨訪，同時(shí)對(duì)納入的患者進(jìn)行治療方法或年齡的分層，以進(jìn)一步證實(shí)DAB2IP和βcatenin在胃癌中的診斷和預(yù)后預(yù)測價(jià)值。