趨化因子受體 3對(duì)乳腺癌調(diào)控機(jī)制的探究及其臨床意義△

陳超英，陳苗苗，劉靈芝，伍仙，朱一喜，何樹光#

1湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院（株洲市中醫(yī)院）檢驗(yàn)科，湖南 株洲 412000

2中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院/株洲市中心醫(yī)院放射影像科，湖南 株洲 412000

乳腺癌是發(fā)生于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。近年來(lái)，乳腺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康，是當(dāng)前社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，目前，其具體的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確[1-2]。趨化因子及其與受體的結(jié)合均對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，而趨化因子受體 3（chemokine receptor 3，CCR3）是CCR家族中的重要成員。據(jù)報(bào)道，CCR3在細(xì)胞的增殖與狀態(tài)轉(zhuǎn)變中發(fā)揮著重要的作用[3-5]，且在嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）中呈高表達(dá)，可促進(jìn)EOS的分化成熟[6-7]。EOS可作為延長(zhǎng)乳腺癌患者生存期的重要指標(biāo)[8]。目前，CCR3對(duì)乳腺癌的調(diào)控機(jī)制尚不十分明確，本研究通過(guò)分析61例乳腺癌患者的乳腺癌組織及其癌旁組織中CCR3的表達(dá)情況，觀察50例乳腺癌患者及50例正常受試者外周血中EOS的計(jì)數(shù)及所占白細(xì)胞比例，探究CCR3對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，旨在為從趨化因子層面發(fā)現(xiàn)治療乳腺癌的新思路和發(fā)掘治療乳腺癌的新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院收治的50例乳腺癌患者作為乳腺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為乳腺癌；均為女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他血液系統(tǒng)疾病，如粒細(xì)胞白血病等；合并嚴(yán)重的感染性疾??；檢測(cè)前一個(gè)星期內(nèi)行化療。乳腺癌組患者的年齡為32～76歲，中位年齡為46歲；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；病理類型：激素受體（hormone receptor，HR）陽(yáng)性乳腺癌36例，HER2陽(yáng)性乳腺癌12例，三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）2例。選取同期50例健康體檢者作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：均為女性；體檢指標(biāo)正常；血常規(guī)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有血液系統(tǒng)疾??；感染性指標(biāo)如白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）升高；患有其他影響研究的相關(guān)疾病，如腫瘤、傳染性疾病、寄生蟲過(guò)敏等。50例對(duì)照組受試者的年齡為30～70歲，中位年齡為43歲。本研究通過(guò)湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)，患者及家屬均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法

采集乳腺癌組患者和對(duì)照組受試者的清晨空腹靜脈血2～3 ml，注入乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediaminetetraacetic acid-K2，EDTA-K2）抗凝管中，輕輕顛倒混勻數(shù)次，備注相關(guān)信息，待測(cè)。運(yùn)用希森美康血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上機(jī)檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行血涂片觀察，測(cè)量EOS數(shù)目及比例3次，記錄平均值。上述過(guò)程每2周重復(fù)進(jìn)行1次，至少進(jìn)行3次，獲取數(shù)據(jù)待分析。

1.3 其他數(shù)據(jù)獲取及分析

從癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）（https://cancergenome.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集共包含532例乳腺癌患者的樣本數(shù)據(jù)，其中，61例浸潤(rùn)性乳腺癌患者的乳腺癌組織具有配對(duì)的癌旁組織樣本數(shù)據(jù)，因此，本研究選取此61例配對(duì)樣本分析CCR3在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況。從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的高通量“基因表達(dá)大棚車（gene expression omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）”基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中下載登錄號(hào)為GSE3494的基因芯片數(shù)據(jù)集，共包含251例乳腺癌患者的乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)。同時(shí)，通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取登錄號(hào)分別為GSE1456、GSE6532、GSE7390的基因芯片數(shù)據(jù)集，共包含914例乳腺癌患者的臨床資料及乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)。根據(jù)CCR3的表達(dá)值將914例乳腺癌患者分為3組：-4.994～-0.625為低表達(dá)組，-0.626～0.776為中等表達(dá)組，0.777～4.164為高表達(dá)組；分析CCR3表達(dá)與乳腺癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存（relapse free survive，RFS）之間的關(guān)系。

1.4 生物信息學(xué)分析

在編號(hào)為GSE3494的基因芯片數(shù)據(jù)集中，以探針208304_at提取CCR3在251例乳腺癌中的表達(dá)值，根據(jù)中位數(shù)，將乳腺癌患者的乳腺癌組織標(biāo)本分為高低兩組，同時(shí)通過(guò)基因集合富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）網(wǎng)站（http://software.broadinstitute.org）下載與乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因子集。采用GSEA3.0軟件對(duì)乳腺癌組織中CCR3的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的關(guān)系進(jìn)行基因富集分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，配對(duì)設(shè)計(jì)樣本采用配對(duì)t檢驗(yàn)；生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，生存情況的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 61例乳腺癌及其癌旁組織中CCR 3 mRNA的表達(dá)情況

分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中61例浸潤(rùn)性乳腺癌及其癌旁組織中CCR3mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CCR3的中位表達(dá)水平為0.865，明顯高于癌旁組織的0.661，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.530，P＜0.01）。

2.2 CCR 3與251例乳腺癌患者乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

通過(guò)對(duì)251例乳腺癌患者的乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行基因富集分析發(fā)現(xiàn)，CCR3的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。與乳腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)的基因子集多數(shù)富集在CCR3高表達(dá)區(qū)的紅色區(qū)域，且與富集在CCR3低表達(dá)藍(lán)色區(qū)域相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015）（圖1A）。CCR3富集在CCR3高表達(dá)區(qū)域，與在轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)的相關(guān)基因子集呈明顯正相關(guān)（P＜0.01）（圖1B）；CCR3富集在CCR3低表達(dá)區(qū)域，與在浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)的相關(guān)基因子集呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.01）（圖1C）。

圖1 CCR 3表達(dá)與251例乳腺癌患者乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移關(guān)系的GSEA分析

2.3 CCR 3與914例乳腺癌患者RFS率的關(guān)系

根據(jù)CCR3的表達(dá)值分為CCR3低表達(dá)組（n=315）、CCR3中表達(dá)組（n=298）、CCR3高表達(dá)組（n=301）。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，三組乳腺癌患者的RFS情況比較，CCR3高表達(dá)組乳腺癌患者的RFS情況更優(yōu)（P=0.008）。（圖2）

圖2914 例乳腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線

2.4 外周血中EOS數(shù)量的比較

通過(guò)對(duì)50例乳腺癌患者和對(duì)照組受試者外周血中的EOS進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者外周血中EOS的計(jì)數(shù)及其所占白細(xì)胞比例中位水平分別為（0.04×109）/L、0.6%，均明顯低于對(duì)照組受試者的（0.15×109）/L、2.4%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.539、4.983，P＜0.01）。

3 討論

乳腺癌是危害女性身心健康的常見惡性腫瘤之一，在中國(guó)及全世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，已成為亟待解決的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不十分清楚。乳腺癌為異質(zhì)性腫瘤，臨床上將乳腺癌分為3個(gè)亞型：HR陽(yáng)性乳腺癌，此類乳腺癌包括雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性和（或）孕激素受體（progestin receptor，PR）陽(yáng)性乳腺癌；人類表皮生長(zhǎng)因子 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）過(guò)表達(dá)乳腺癌；TNBC——缺乏ER和PR表達(dá)，HER2表達(dá)水平正?；蜿幮员磉_(dá)[9]，分子標(biāo)記不同，治療方式、預(yù)后及對(duì)治療的反應(yīng)均不同[1]。而趨化因子及其受體在許多疾病尤其腫瘤中發(fā)揮著重要的作用，而其在乳腺癌中作用機(jī)制的研究尚處于起步階段。

CCR3作為趨化因子家族中的重要成員之一，CCR3基因位于染色體3p21，具有5個(gè)外顯子，編碼373個(gè)氨基酸。起初被定義為EOS介導(dǎo)受體，也有報(bào)道稱其為嗜堿性粒細(xì)胞激活的生物標(biāo)志物[10-11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CCR3不但能夠促進(jìn)黑色素瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并轉(zhuǎn)化細(xì)胞狀態(tài)形成新的血管[3-5]。研究表明，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CCR3在乳癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01），但是CCR3蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分型等無(wú)關(guān)[12]。

本研究結(jié)果顯示，61例浸潤(rùn)性乳腺癌組織中的CCR3處于高表達(dá)狀態(tài)，且乳腺癌患者外周血中EOS的計(jì)數(shù)及其所占白細(xì)胞比例中位水平均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），表明EOS參與對(duì)乳腺癌的調(diào)控。且有研究還發(fā)現(xiàn)，EOS對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用，而CCR3為EOS的介導(dǎo)受體，可募集EOS[13]，表明EOS可能參與CCR3對(duì)乳腺癌的調(diào)控過(guò)程。本研究通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CCR3的高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因通路子集呈正相關(guān)，表明CCR3可能通過(guò)EOS調(diào)控乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過(guò)對(duì)251例乳腺癌患者的乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行基因富集分析發(fā)現(xiàn)，CCR3的表達(dá)與乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明CCR3可提高乳腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率。

CCR3需要與其配體結(jié)合方能發(fā)揮對(duì)腫瘤的調(diào)控作用；該過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，而乳腺癌中CCR3與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因子集呈正相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生同樣是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的因素有很多，不一定局限于某種特定的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方式，也可能與其他轉(zhuǎn)移方式有關(guān)，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）的形成，同時(shí)CCR3可能通過(guò)調(diào)控機(jī)體的免疫系統(tǒng)影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。同樣，本研究探究了乳腺癌組織中CCR3的表達(dá)情況及其與患者RFS情況之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CCR3的表達(dá)可以提高乳腺癌患者的RFS率。

綜上所述，CCR3可能通過(guò)EOS對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)控，但CCR3是否可在乳腺癌中發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移以及提高患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率的雙重作用，還有待進(jìn)一步深入探究。