馬齒莧結合態(tài)多酚和自由態(tài)多酚抑制肝癌細胞HepG-2增殖及誘導細胞凋亡的研究

王浩毓，趙惠玲，李宏全*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801；2.太原師范學院 生物系，山西 太原 030012)

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，在全世界惡性腫瘤的發(fā)病率中占第5位，在腫瘤引起死亡的排名中居于第3位[1]，具有高發(fā)病率、高侵襲性、高轉(zhuǎn)移率、預后差等臨床特點。因其發(fā)病的分子機制至今沒有明確而成為較為難治療的疾病之一[2]。隨著早期診斷技術的提高，患者的存活率也開始有一定提高，但仍有一部分晚期肝癌難以切除，且易轉(zhuǎn)移和復發(fā)[3]。肝癌的治療方法主要是綜合治療，包括化療、放療、手術切除、免疫治療以及介入治療等[4]。單孔腹腔鏡的普及為肝癌的手術治療做出了一定的貢獻，為減輕患者疼痛，減少術后感染提供了保障，但對于晚期肝癌來說，并未做到根本性改善[5]。除此之外，臨床上還有射頻消融 (RFA)、高頻熱療 (HFH) 以及樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞 (DC/CIK)等較為新型的治療方式，但因投入應用的案例還較少，而無法詳細了解其療效[6]。到目前為止，依然沒有出現(xiàn)能徹底消滅癌細胞，并且副作用較小的治療方案。因此，開發(fā)高效、低毒的新型抗肝癌藥物仍是當務之急。

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)是我國一種傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解毒、涼血止血的功效，主治熱痢膿血、熱淋、帶下、痛腫惡毒、丹毒[7]，其提取物已被證實具有抗氧化、抗腫瘤[8]、增強免疫、抗衰老[9]、抗炎、抑菌[10]、保護神經(jīng)元[11]、降血糖[12]等作用。馬齒莧中含有槲皮素、山柰酚、木犀草素[13]以及3,4-二羥基苯乙醇等[14]多種多酚。

多酚是廣泛存在于植物性食物中一種化合物，具有很好的抗氧化作用，且經(jīng)流行病學數(shù)據(jù)證明是安全無毒的，并對人類健康有持久有利的影響[15]。近年來，人們對多酚進行了更加深入的研究，并發(fā)現(xiàn)該化合物具有除抗氧化外還具有更廣泛的作用。于萍[16]曾發(fā)現(xiàn)葡多酚可促進正常乳腺細胞的增殖活性并呈現(xiàn)劑量效應關系，但對乳腺癌細胞增殖活性有抑制作用且呈一定的濃度依賴關系。Shan等[17]從棗中提取結合態(tài)多酚，并發(fā)現(xiàn)其在裸鼠腫瘤模型中表現(xiàn)出了抗腫瘤活性，且對正常器官不造成損傷。史江穎等[18]發(fā)現(xiàn)谷糠結合態(tài)多酚對人肝癌細胞(HepG-2)、人宮頸癌細胞(Hela)、人乳腺癌細胞(MCF-7)、人結腸癌細胞(HCT-7)具有顯著的增殖抑制作用。

多酚根據(jù)其存在的形態(tài)可分為自由態(tài)(或游離態(tài))多酚和結合態(tài)多酚。自由態(tài)多酚一般為單體形式，并以物理方式吸附于植物性食物基質(zhì)中。因此，自由態(tài)多酚易溶于有機溶劑或水。結合態(tài)多酚則是由共價鍵與植物細胞壁等基質(zhì)結合，因此較難提取，一般采取酸或堿水解提取。本文以馬齒莧自由態(tài)多酚(free polyphenol inPortulacaoleraceaL, FPPO)和結合態(tài)多酚(bound polyphenol inPortulacaoleraceaL., BPPO)為干預材料，以肝癌細胞HepG-2為模型，對馬齒莧多酚抑制HepG-2肝癌細胞增殖及誘導HepG-2凋亡作用進行了初步研究，旨在尋找低毒有效的抗肝癌藥物。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞株

肝癌細胞株 HepG-2，由山西省腫瘤醫(yī)院中心實驗室郭素堂教授惠贈。

1.1.2 藥物與試劑

馬齒莧 (PortulacaoleraceaL.) 采集于山西省壽陽縣朝陽鎮(zhèn)中曲村的田間，并由北京師范大學生命科學學院劉全儒教授鑒定，確認為野生馬齒莧；Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活性檢測試劑盒、Bradford法蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒均購于碧云天生物技術；RPMI Medium1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜、胰蛋白酶、沒食子酸、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、鹽酸、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、氫氧化鈉等均購于北京索萊寶；四季青無支原體胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

流式細胞儀購自美國BD公司；離心機購自德國Hettich科學儀器公司；超純水儀購自英國ELGA公司；分光光度計購自中國濟南博華儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱購自英國RS Biotech公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS株式會社；酶標購自瑞士TECAN公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬齒莧結合態(tài)與自由態(tài)多酚的提取與含量測定

自由態(tài)多酚的提?。簩⒉杉降鸟R齒莧室溫下干燥，用粉碎機粉碎成粉末，過80目篩，分析天平稱取20 g粉末，加入-20 ℃預冷的75%丙酮500 mL 攪拌20 min，4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，沉淀按上述步驟再處理一遍并收集上清。將2次收集到的上清液 45 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200 mL，并依次分裝在10 cm 培養(yǎng)皿中，經(jīng)冷凍干燥機持續(xù)處理24 h，即得到FPPO[17]。

結合態(tài)多酚的提?。簩⑻崛∽杂蓱B(tài)多酚后的殘留物中加入200 mL 2 mol·L-1的NaOH 進行消化反應，室溫下攪拌1 h，加HCl 使 pH=7以終止反應，再加入200 mL己烷，反應20 min除去脂質(zhì)，4 000 r·min-1離心10 min, 收集上清，重復上述步驟一次。將收集到除脂后的液體中加入200 mL 乙酸乙酯提取20 min, 4 000 r·min-1離心10 min, 收集除脂的液體，重復上述步驟3次。將提取液45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200 mL，真空冷凍干燥，最終得到BPPO[17]。

馬齒莧多酚的含量測定：以沒食子酸為標準品，福林酚法檢測多酚的濃度，以標準曲線為y=0.1932x-0.0207(R2=0.994)計算自由態(tài)和結合態(tài)多酚的含量。

1.2.2 HepG-2細胞培養(yǎng)

冷凍的HepG-2細胞復蘇后，在無菌操作狀態(tài)下接入細胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%的胎牛血清1640培養(yǎng)基，放到37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間觀察更換培養(yǎng)基。待HepG-2細胞對數(shù)生長至培養(yǎng)瓶底95%時，傳代培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測FPPO和BPPO對HepG-2細胞的抑制率

當HepG-2細胞對數(shù)生長至培養(yǎng)瓶底的95%時，0.2%胰酶消化，1 000 r·min-1離心5 min，1640培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細胞濃度為6×104個·mL-1，每孔100 μL接入96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，更換新的加入多酚的培養(yǎng)基，多酚濃度梯度為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g·L-1，每個濃度平行5個孔，培養(yǎng)12 h、24 h和36 h后，加入20 μL MTT, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去液體，加入150 μL DMSO，酶標儀搖動10 min，570 nm波長測定吸光度值。根據(jù)抑制率/%=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%計算不同濃度和不同時間多酚作用下的抑制率。

1.2.4 細胞形態(tài)學觀察

將傳代培養(yǎng)的HepG-2細胞調(diào)整濃度至5×104個·mL-1，接入12孔板中，每孔1 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h且完全貼壁后，更換新的加入多酚的培養(yǎng)基，多酚濃度梯度為0、0.1、0.2、0.3 g·L-1，培養(yǎng)24 h，OLYMPUS倒置顯微鏡拍照(20X)觀察。

1.2.5 流式細胞術實驗

1.2.5.1 BPPO對HepG-2細胞周期影響實驗

傳代懸浮的HepG-2細胞，調(diào)整濃度至5×104個·mL-1，接入直徑6 cm的皿中，每皿3 mL，搖勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，更換含有BPPO的培養(yǎng)基，BPPO濃度分別為0、0.1、0.2、0.3 g·L-1，每個濃度重復3次。培養(yǎng)24 h后，0.2%胰酶消化，PBS洗滌2次，70%酒精固定24 h，PBS洗滌固定液，調(diào)整細胞濃度為1×106個·mL-1，加入100 μL RNaseA，再加入400 μL PI，避光反應30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5.2 BPPO誘導HepG-2細胞凋亡實驗

HepG-2細胞傳代、鋪皿、BPPO干擾、胰酶消化PBS洗滌離心后，加入195 μL AnnexinV-FITC結合液，5 μL AnnexinV-FITC，10 μL碘化丙啶，搖勻，避光反應15 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5.3 BPPO對HepG-2細胞線粒體膜電位影響實驗

HepG-2細胞BPPO干擾、胰酶消化、PBS洗滌與1.2.5.1相同，PBS洗滌離心后，加入1640培養(yǎng)基和JC-1染色工作液各500 μL，37 ℃恒溫箱中溫浴20 min，JC-1染色緩沖液洗滌離心后懸浮HepG-2細胞，流式細胞儀檢測。

1.2.6 BPPO對HepG-2細胞Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9酶活性影響實驗

HepG-2細胞經(jīng)BPPO干擾、胰酶消化、PBS洗滌離心后，加入100 μL裂解液，冰浴裂解15 min，根據(jù)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9檢測試劑盒說明書加樣，搖勻后37 ℃反應90 min，酶標儀檢測A405吸光度值，計算Caspase酶活力單位。

1.3 統(tǒng)計分析

每個樣品至少3次重復，結果以平均值±標準差(mean ± SD)表P<0.05示。方差分析及相關性分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，多重比較采用S-N-K法。柱形圖、線型圖采用SPSS 22.0軟件繪制。細胞周期圖、細胞凋亡圖、線粒體膜電位圖由FACSCalibur流式細胞儀生成。顯著性水平為P<0.05 或P<0.01。

2 結果與分析

2.1 馬齒莧結合態(tài)多酚和自由態(tài)多酚的含量

丙酮作為常用的有機溶劑可以將FPPO溶出，并去除大部分雜質(zhì)。用NaOH處理殘留物，可以使BPPO與植物基質(zhì)間的化學鍵高效水解，游離到溶劑當中。利用福林酚法檢測多酚含量，代入用沒食子酸建立的標準曲線中，測得BPPO濃度約為5.912 g·L-1，F(xiàn)PPO為8.267 g·L-1。20 g馬齒莧干粉末最終提取出約71 mg BPPO，264.5 mg FPPO。FPPO的提取率顯著高于BPPO(見表1)。

表1 BPPO和FPPO含量/mgTable 1 The contents of bound and free polyphenols in Portulaca oleracea L.

注：A、B、C...等大寫字母表示檢測指標達到0.01顯著性水平差異，a、b、c...等小寫字母表示檢測指標達到0.05顯著性水平差異。

Note：the capital letters (A, B, C etc) indicate that the significant differences between each of detection indexes have reached a level of 0.01 (P<0.01), the lower case letters (a, b, c etc) indicate that the significant differences between each of detection indexes have reached a level of 0.05 (P<0.01).

2.2 馬齒莧兩種形態(tài)多酚對HepG-2肝癌細胞的抑制作用

BPPO對HepG-2細胞的抑制率呈劑量依賴性增長，0.4 g·L-1時抑制率最高(圖1，圖2)。隨著處理時間的增加(12、24、36 h)，其抑制率也逐步變強，36 h、0.4 g·L-1下的作用效果最強，抑制率達到了73%(見圖1右)。FPPO由于作用效果太弱，在12、24 h抑制率幾乎為0(圖1B)。在相同時間內(nèi)，BPPO對HepG-2的抑制作用在各濃度梯度上(0.0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g·L-1)均明顯強于FPPO(圖2)。

圖2 相同處理時間、不同處理濃度下FPPO與BPPO對HepG-2肝癌細胞的抑制率比較Fig.2 Inhibition analysis of FPPO and BPPO on HepG-2 hepatoma cells at same treatment time

為了更明了地探究BPPO對HepG-2抑制效果與處理時間的關系，我們計算了結合態(tài)多酚不同處理時間下的IC50值。隨著作用時間延長，IC50值極顯著地減小。12 h、24 h、36 h的IC50值依次為0.325、0.273、0.216 g·L-1，三者之間均達到極顯著性差異(P<0.01)。這說明BPPO對HepG-2細胞的抑制作用隨著時間的延長而顯著增強(圖3)。

2.3 BPPO對HepG-2肝癌細胞形態(tài)結構的影響

由圖4可見，在倒置顯微鏡下觀察HepG-2肝癌細胞經(jīng)BPPO處理24 h后的細胞形態(tài)，對照組細胞形態(tài)呈梭形，細胞之間緊密連接，貼壁牢固；HepG-2肝癌細胞經(jīng)BPPO處理5 h開始回縮，逐漸變圓，細胞形態(tài)變化與BPPO的作用時間和濃度呈正相關，隨著BPPO濃度增加，細胞變圓的數(shù)量增加，隨著作用時間不斷延長，圓形細胞脫離培養(yǎng)皿底部，漂浮到細胞培養(yǎng)液中。

圖3 BPPO不同時間作用于HepG-2肝癌細胞的半抑制濃度Fig.3 The half maximal inhibitory concentration of BPPO on HepG-2 cells at different time

圖4 不同濃度BPPO作用下的HepG-2肝癌細胞形態(tài)圖Fig.4 The HepG-2 cells’ morphology after treated by different concentration of BPPO

2.4 BPPO對HepG-2肝癌細胞周期的影響

本試驗利用流式細胞儀檢測了BPPO對HepG-2肝癌細胞周期分布的影響，由圖5可見，與對照組相比，隨著處理濃度的增加G1期細胞比例呈劑量依賴性顯著下降(P<0.01)；隨著處理濃度的增加S期細胞的比例呈劑量依賴性增加(P<0.05)，且除低劑量組之外，均極顯著地高于對照組(P<0.01)；G2期細胞比例隨著處理濃度的增加呈劑量依賴性下降(P<0.05)。以上差異均具有統(tǒng)計學意義。這說明BPPO將HepG-2細胞阻滯在了S期。

2.5 BPPO對HepG-2肝癌細胞凋亡的影響

圖6結果顯示，在BPPO作用下，隨著處理濃度增加，正常細胞的比率極顯著地降低，早期凋亡和晚期凋亡的細胞比率極顯著地增加。且在早期凋亡中，相比于對照組的1.72%，高劑量組的凋亡比例增加到了 54.62%，達到極顯著性差異(P<0.01)。

2.6 BPPO對 HepG-2肝癌細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活性的影響

圖7結果表明，隨著馬齒莧結合態(tài)多酚處理濃度的增加，HepG-2肝癌細胞中Caspase-3、Caspase-8 酶活性隨著處理濃度的增加，酶活性極顯著地提高，在0.0、0.1、0.2、0.3 g·L-1濃度相互之間均達到極顯著性差異(P<0.01)。Caspase-9酶活性也是隨著BPPO處理濃度的增加而增加，0.1 g·L-1濃度處理與對照之間差異極顯著(P<0.01)，0.2、0.3 g·L-1處理與對照和 0.1 g·L-1濃度處理之間存在極顯著差異(P<0.01)。

2.7 BPPO對HepG-2肝癌細胞線粒體膜電位的影響

圖8為JC-1法檢測的HepG-2肝癌細胞線粒體膜電位，結果顯示，隨著BPPO處理濃度的增加，線粒體膜電位下降程度極顯著地提高，由對照組的 11.41%增加到了高濃度組的54.52%，達到極顯著性差異(P<0.01)。

圖5 不同濃度BPPO作用下的HepG-2肝癌細胞周期圖Fig.5 The cell cycle diagrams of HepG-2 hepatoma cells after treated by different concentration of BPPOA、B、C...等大寫字母表示檢測指標達到0.01顯著性水平差異，a、b、c...等小寫字母表示檢測指標達到0.05顯著性水平差異，下圖同。The capital letters (A, B, C etc) indicate that the significant differences between each of detection indexes have reached a level of 0.01 (P<0.01), the lower case letters (a, b, c etc) indicate that the significant differences between each of detection indexes have reached a level of 0.05 (P<0.01), the same as the figures below.

圖6 AnnexinV-FITC染色檢測到的HepG-2肝癌細胞凋亡圖Fig.6 Apoptosis diagram of HepG-2 hepatoma cellsdetected by Annexin V-FITC staining after BPPO treatmentLL象限代表活細胞；LR象限代表早期凋亡；UR象限代表晚期凋亡；UL象限代表壞死。The LL quadrant represents living cells; the LR quadrant represents early apoptosis; the UR quadrant represents late apoptosis; the UL quadrant represents necrosis.

圖7 BPPO對HepG-2 細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活性影響Fig.7 Effects of BPPO on Caspase-3, Caspase-8 and Caspase-9 enzymes activity in HepG-2 cells

圖8 JC-1法檢測HepG-2肝癌細胞線粒體膜電位圖Fig.8 Mitochondrial membrane potential detected by JC-1on HepG-2 hepatoma cells after treatment of different BPPO concentration

3 討論

3.1 關于馬齒莧多酚

馬齒莧是一種常見的一年生草本植物，具有抗氧化、抗衰老和改善認知的功能。馬齒莧抗腫瘤的作用在近年來也得到了驗證。 Zhao等[19]研究表明，馬齒莧中的水溶性多糖POL-P3b可以顯著抑制宮頸癌HeLa細胞；Shen[20]發(fā)現(xiàn)馬齒莧中的多種糖類都可以抑制sacroma 180在小鼠體內(nèi)的增長。

多酚是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于蔬菜和水果以及種子的麩皮中[21]。多酚的主要功能為抗氧化和抗微生物[22]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)多酚具有一定的抗癌作用。董麗華[23]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚能顯著抑制人結腸癌Caco-2細胞，并誘導其凋亡；高曉天[24]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可誘導人肺癌細胞凋亡；章迅[25]研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚能夠抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞的增殖。多種多酚都對HepG-2肝癌細胞具有抑制作用，史江穎[18]研究表明，谷糠結合態(tài)多酚對HepG-2肝癌細胞有明顯的增殖抑制作用；Shan[17]研究表明，棗結合態(tài)多酚對HepG-2肝癌細胞也有明顯的增殖抑制作用。

馬齒莧富含山柰酚、芹黃素、木犀草素、楊梅素和槲皮素等多酚類化合物。因此，研究馬齒莧中多酚的抗癌作用具有很大的臨床意義，為天然藥物治療和緩解癌癥提供了一定的基礎理論依據(jù)。本實驗從馬齒莧中提取了BPPO和FPPO2種類型的多酚，并詳細研究了該多酚對HepG-2肝癌細胞的抑制作用。

3.2 BPPO抑制HepG-2肝癌細胞增殖

本研究利用MTT法檢測BPPO和FPPO對HepG-2細胞抑制率，結果表明(圖1)，BPPO能夠抑制HepG-2肝癌細胞增殖，并具有時間和濃度依賴性，36 h BPPO的IC50值達到最低，為0.216 g·L-1(圖3)。BPPO在24 h對HepG-2的IC50值為0.273，相同時間下谷糠結合態(tài)多酚對HepG-2的IC50值為0.84 g·L-1[18]，棗結合態(tài)多酚對HepG-2的IC50值為0.3 g·L-1[17]，均高于本實驗的測定值，表明不同來源的結合態(tài)多酚對HepG-2肝癌細胞的敏感性是不同，BPPO的抑制作用優(yōu)于棗結合態(tài)多酚和谷糠結合態(tài)多酚。

FPPO對HepG-2肝癌細胞作用相對較弱，其作用濃度0.4 g·L-1、作用時間36 h時抑制率僅為15.7%，抑制率達到30%以上時，才能確定細胞會發(fā)生凋亡，故本文著重對BPPO做了研究。

3.3 BPPO對HepG-2肝癌細胞周期的影響

S期是細胞DNA合成期。組蛋白也是在這一時期合成，染色體的構成離不開組蛋白。本研究結果表明，BPPO將HepG-2細胞阻滯在S期，而對該細胞的G1期和G2期沒有顯著影響，而G2期的細胞含量少于G1期和S期。說明BPPO可能破壞了HepG-2細胞內(nèi)的堿基，損傷的堿基不能進行DNA合成，使G1期細胞減少,使G2期細胞無法大量合成有絲分裂所需蛋白，從而抑制腫瘤細胞的增殖，促進HepG-2肝癌細胞凋亡。BPPO還可能通過影響組蛋白的乙?；揎?，進而影響細胞內(nèi)的DNA的合成，這一推測還有待進一步探究[26]。Shan等[17]發(fā)現(xiàn)棗結合態(tài)多酚可將HepG-2肝癌細胞周期阻滯在S期，與本研究中的 BPPO作用結果一致。

3.4 BPPO誘導HepG-2肝癌細胞凋亡

本研究通過利用Annexin V/PI雙染法流式細胞術(圖5)證明了BPPO可誘導HepG-2肝癌細胞的凋亡。在此基礎上，本研究通過探究BPPO對HepG-2肝癌細胞線粒體膜電位的影響以及其對膜受體通路的影響來進一步說明BPPO對 HepG-2細胞凋亡的作用機制。

在膜受體凋亡通路中，Caspase 8是關鍵，它在被誘導活化后可激活其效應物Caspase 3。Caspase 3 經(jīng)激活后可水解成活性酶的形式，形成級聯(lián)反應，催化DNA修復酶(polyADP-ribosepolymerase，PARP)的裂解，并在其他酶的協(xié)同作用下裂解整個細胞[27]。

經(jīng)證明，多酚具有誘導Caspase 8激活的功能。李萍等[28]發(fā)現(xiàn)茶多酚能夠激活ACC-M細胞中Caspase8， Gupta等[29]發(fā)現(xiàn)茶多酚可誘導人類前列腺癌細胞Caspase8活性增加。本研究利用Caspase檢測試劑盒對BPPO作用下的HepG-2細胞中的Capase 8、Capase 3和Capase 9進行檢測。結果顯示Caspase 3和Caspase 8均有所升高，從而證明了BPPO通過膜受體通路誘導HepG-2細胞凋亡。此外，由于Caspase 9也升高，因此可推測HepG-2的凋亡和線粒體膜電位降低有關。

線粒體的變化同樣可以誘導細胞凋亡。在細胞凋亡前期，細胞膜電位的降低，可使具有調(diào)控能量代謝和細胞凋亡雙重功能的 CytC等釋放于胞漿內(nèi)，并與細胞凋亡酶活化因子1結合，在dATP的幫助下激活Caspase 9,進而激活Caspase 3,從而形成級聯(lián)反應，使細胞凋亡[30]。同時，線粒體膜的損傷，也會使線粒體呼吸鏈受損，導致生成細胞三磷酸腺苷減少，加速了細胞凋亡進程[31]。

本研究在BPPO作用于HepG-2使其Caspase 9升高的基礎上，對其線粒體膜電位進行檢測。結果顯示在BPPO處理后的HepG-2細胞的線粒體膜電位顯著下降，從而證明BPPO可通過線粒體介導的內(nèi)源性凋亡通路誘導細胞凋亡。

本研究表明，對HepG-2細胞而言，BPPO對其有較強的抑制作用，且呈劑量依賴型。FPPO對HepG-2細胞的影響則不明顯。此外，BPPO很可能是通過通過激活膜受體通路和線粒體介導的內(nèi)源性凋亡通路誘導HepG-2細胞凋亡，從而對肝癌細胞起到抑制作用。

肝癌由于其易復發(fā)易轉(zhuǎn)移的特點，而成為一種很難治愈的疾病。近年來，人們不斷嘗試新的治療方法，旨在擺脫毒副作用大的傳統(tǒng)療法。一些生物類藥物在這方面取得一定進展，但仍不能成為符合預期的高效藥物。馬齒莧多酚作為一種純天然提取物，在減少身體損傷，提高治愈率方面，具有很好的前景。

馬齒莧的自由態(tài)多酚與結合態(tài)多酚對肝癌細胞的抑制功效的差異很可能是因為兩者所含的酚類化合物有所不同。因此，我們下一步將基于此推測，對馬齒莧多酚的種類進行更深入的研究，以期找到對肝癌細胞作用最大的酚類化合物，并利用小鼠模型探究其體內(nèi)功能。

4 結論

綜上所述，BPPO可以顯著抑制HepG-2肝癌細胞的增殖，且具有時間和濃度依賴性，同時對細胞的形態(tài)也有明顯的影響。BPPO可以阻滯HepG-2肝癌細胞周期至S期，并誘導細胞凋亡。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活性的升高和細胞線粒體膜電位的下降表明，BPPO誘導細胞凋亡是通過是激活膜受體通路和線粒體介導的內(nèi)源性凋亡通路來完成的。