視黃醇對仔豬睪丸支持細胞體外生物學特性的影響

鄧嘉強，鐘麗君，劉歡歡，曹隨忠，沈留紅，余樹民

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

視黃醇(維生素A)是一類常見的脂溶性物質(zhì)，視黃醇及其主要衍生物是維持機體生命活動、正常生理功能的必需化合物，具有促氧化和抗氧化的雙重效應[1]。已有研究表明，視黃醇及其活性衍生物通過影響哺乳動物睪丸支持細胞(sertoli cell，SC)增殖發(fā)育和精原細胞減速分裂周期對雄性動物精子發(fā)生和睪丸發(fā)育發(fā)揮重要調(diào)控作用[2-4]。視黃醇缺乏或過量，均會引起睪丸病變和精子發(fā)生障礙[4-5]。

支持細胞是睪丸曲細精管上皮的主要組成細胞，為發(fā)育中的雄性生殖細胞提供微環(huán)境和免疫保護功能[6-8]，支持細胞在調(diào)控睪丸發(fā)育[9]、精子發(fā)生[10]、精原干細胞(spermatogenial stem cells，SSCs)增殖和分化等過程中均具有不可或缺的作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，初情期前期睪丸支持細胞可以通過合成和分泌一系列細胞因子調(diào)節(jié)SSCs增殖和分化[13]，如膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurophic factor，GDNF)[14-15]、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)[16]、干細胞因子(stem cell factor，SCF)[17]、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF2)[18]等。支持細胞是睪丸內(nèi)視黃醇及其衍生物作用的最主要靶細胞，視黃醇通過支持細胞介導，在雄性動物生殖功能中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8]，因此其常被選作研究視黃醇調(diào)節(jié)雄性動物生殖功能的體細胞。目前對于視黃醇作用支持細胞的研究主要集中于裂齒動物[2-3]，對仔豬睪丸支持細胞生物學功能的研究較少。本試驗在體外條件下添加視黃醇，通過分析支持細胞活性、增殖及凋亡相關(guān)基因的表達和細胞因子轉(zhuǎn)錄和分泌情況，評價視黃醇對仔豬睪丸支持細胞的體外生物學特性的影響，為進一步闡明視黃醇在支持細胞內(nèi)的代謝，以及視黃醇通過支持細胞介導調(diào)控雄性動物生殖機能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3～5周齡仔豬睪丸樣品取自于雅安某規(guī)模化豬場。

CCK-8試劑盒，日本Dojindo Laboratories公司；Cell AmpTMDirect RNA prep Kit for Real Time RT-PCR，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；全反式視黃醇，美國Sigma公司；FBS和DMEM高糖培養(yǎng)基，美國Gibco公司；IV型膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和DNase I酶，美國Amresco公司；高純總RNA快速提取試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit和Premix TaqTM，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；ELISA試劑盒，美國Rapidbio公司。

1.2 方法

1.2.1 仔豬睪丸支持細胞的分離純化

無菌采集仔豬睪丸，置于無菌PBS中，75%酒精浸泡3 min，去除附睪和白膜后，取實質(zhì)剪成l～2 mm3大小。參照文獻[19]，剪碎的組織先用0.25% IV型膠原酶和0.1%透明質(zhì)酸酶共同消化60 min，再用0.25%胰蛋白酶和0.1% DNase I共同消化20 min，經(jīng)過濾、離心和洗滌后，將細胞沉淀用含10% FBS的DMEM重新懸浮。最終以(0.5～1)×106cells·mL-1接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)2 h后，收集懸液接種培養(yǎng)5～6 h，移除懸浮細胞，用20 mmol Tris-HCl處理5 min，洗滌后添加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，將細胞培養(yǎng)至第3代，用于后續(xù)試驗。

1.2.2 CCK-8檢測支持細胞活性

取對數(shù)生長期細胞，以(6～8)×104cells·mL-1接種于96孔板，每孔100 μL，過夜培養(yǎng)后更換培養(yǎng)液，分別添加濃度為0、0.005、0.025、0.125、0.625、1.250、2.500、5.000和10.000 μmol·L-1的視黃醇，不添加視黃醇的作為空白對照，每組3個重復，培養(yǎng)24 h和72 h后分別用CCK-8試劑盒檢測細胞活力，以培養(yǎng)72 h后顯著抑制細胞活性的視黃醇最小濃度繪制支持細胞生長曲線。

1.2.3 RT-PCR檢測支持細胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達

取對數(shù)生長期支持細胞，以(6～8)×104cells·mL-1接種于96孔板，每孔100 μL，過夜培養(yǎng)后更換培養(yǎng)液，實驗組添加1.250 μmol·L-1視黃醇，對照組(C)不做任何處理，每組設置3個重復，在培養(yǎng)12 h、3 d和5 d后分別抽提細胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和擴增后，進行凝膠電泳，經(jīng)凝膠成象儀成象，分析細胞增殖相關(guān)基因(PCNA、C-MYC和BCL-2)和凋亡相關(guān)基因(CASP3和BAX)表達情況。PCR引物序列參見表1，凝膠成像結(jié)果用Image J進行灰度值分析，用GAPDH標準化蛋白表達量，以目的基因灰度值與GAPDH的灰度值比值作為其相對表達量。

1.2.4 支持細胞中細胞因子轉(zhuǎn)錄與合成檢測

獲取對數(shù)生長期支持細胞，以2×105cells·mL-1接種于96孔板。在基礎培養(yǎng)液(含10%FBS)中培養(yǎng)2 d，更換含5% FBS培養(yǎng)液，對照組(C)不添加視黃醇，試驗組添加1.25 μmol·L-1視黃醇，分別于培養(yǎng)24 h和72 h后取樣，每組3個重復，對基因GDNF、LIF、CSF-1、FGF2、EGF、GAPDH的轉(zhuǎn)錄進行檢測。

表1 基因引物參數(shù)

Table1Primer parameters of genes

基因gene引物Primer5′→3′序列Sequences (5′→3′)Tm產(chǎn)物Product/bpPCNAPCNA-FTTCTTTCTTCCACCTGTAGC56470PCNA-RCACCAGAAGGCATCTTTACTBCL-2BCL-2-FCTTTGCCGAGATGTCCAGC58197BCL-2-RTCCACAGGGCGATGTTGTCBAXBAX-FGCCGAAATGTTTGCTGAC57170BAX-RGCCGATCTCGAAGGAAGC-MYCC-MYC-FTCATCAAAAACATTATCATCCA58235C-MYC-RCTGTCGTTGAGCGGGTAGCASP3CASP3-FTTGGAACAAATGGACCTG56146CASP3-RACTGACCGTCTCAATCCCGDNFGDNF-FCCTTGTGTTGAGGAACAG57204GDNF-RTCCTGGGCAAACATTTGCLIFLIF-FTCACTCCTGTCAATGCCACC57261LIF-RCCAAGGTAGGCGATGATGCCSF-1CSF-1-FGAGGTGTCGGAGAACTGTAGC58220CSF-1-RTGGCATTGGGAGTGTTGTCFGF2FGF2-FGAAGAGCGACCCTCACATCAA58219FGF2-RCAGTGCCACATACCAACTGGAEGFEGF-FATGCTGCTCTTCCTTATCCT55274EGF-RCGACCCAATAGATTCTTTCCGAPDHGAPDH-FTCGGAGTGAACGGATTTG56219GAPDH-RCCTGGAAGATGGTGATGG

分別收集細胞樣品和細胞培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)液經(jīng)3 500 r·min-1離心20 min，吸取上清液分裝于2 mL凍存管內(nèi)，-80 ℃凍存。細胞樣品經(jīng)消化、離心及洗滌后，將細胞沉淀用PBS重懸至密度為5×105cells·mL-1，通過反復凍融過程破壞細胞膜，從而釋放胞內(nèi)物質(zhì)，再經(jīng)3 500 r·min-1離心20 min，收集上清，置于-80 ℃凍存。ELISA法分別檢測細胞樣品和培養(yǎng)液樣品中GDNF、FGF2、CSF-1、LIF和EGF的含量，用新鮮的高糖DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照(C)。

1.3 統(tǒng)計分析

每次試驗設置3次重復，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，通過軟件SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和單因素方差分析，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 支持細胞的分離純化

原代支持細胞開始貼壁時多呈無規(guī)則多角形(圖1-a)，當培養(yǎng)至相鄰細胞融合成片時，進行傳代；第1、3代細胞生長旺盛，培養(yǎng)初期細胞呈短梭型(圖1-b、c)；傳至第5代，細胞出現(xiàn)老化，增殖速度變慢，胞內(nèi)可見空泡或顆粒(圖1-d)。

2.2 視黃醇對支持細胞體外活性影響

如圖2所示，當視黃醇添加濃度小于5.000 μmol·L-1時，培養(yǎng)24 h的細胞活性與對照組相比無明顯差異，而濃度達到5.000 μmol·L-1及以上時細胞活性受到顯著抑制(P<0.05)；當視黃醇添加濃度高于0.125 μmol·L-1時，對培養(yǎng)3 d的支持細胞活性呈現(xiàn)顯著抑制(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依耐性，當濃度達到1.250 μmol·L-1時表現(xiàn)極顯著抑制(P<0.01)。

a～d分別為原代、第1、3、5代分別培養(yǎng)至第2天的支持細胞。a-d represented the primary cells， P1， P3 and P5 represented sertoli cells cultured for 2 d.圖1 仔豬睪丸支持細胞的分離培養(yǎng)Fig.1 Isolation and culture of sertoli cells

a、b分別為細胞培養(yǎng)24 h和3 d后細胞活力檢測結(jié)果。*表示與對照組差異顯著(P<0.05)，* *表示與對照組差異極顯著(P<0.01)。下圖同。a and b represented cell viability assay results after 24 h and 3 d. * represented significant difference at P<0.05， * * represented significant difference at P<0.01. The same as below.圖2 視黃醇對睪丸支持細胞活性的影響Fig.2 Effects of retinol on sertoli cell viability of testicular

以1.250 μmol·L-1作為后續(xù)實驗視黃醇添加濃度，該濃度下支持細胞生長曲線如圖3所示，視黃醇添加組和對照組生長趨勢基本一致，0～2 d為潛伏期，3 d進入對數(shù)生長期，7 d后進入平臺期。結(jié)果表明，視黃醇對支持細胞活性具有抑制作用，且這種抑制作用具有時效性和劑量依賴性。

2.3 視黃醇對支持細胞增殖和凋亡的影響

與對照組相比，視黃醇添加組支持細胞增殖相關(guān)基因的表達量顯著下調(diào)，凋亡相關(guān)基因的表達量顯著上調(diào)(圖4)。12 h時視黃醇添加組PCNA相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，而12 h后，視黃醇組PCNA相對表達量極顯著下調(diào)(P<0.01)；視黃醇添加組CASP3的表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)；視黃醇添加組C-MYC相對表達量在3 d和5 d時極顯著低于對照組(P<0.01)；視黃醇組BCL-2相對表達量在各個時期均極顯著低于對照組(P<0.01)；視黃醇組BAX相對表達量5 d時極顯著高于對照組(P<0.01)。結(jié)果表明，添加視黃醇可以顯著下調(diào)支持細胞內(nèi)增殖相關(guān)基因(PCNA、BCL-2和C-MYC)表達，上調(diào)凋亡相關(guān)基因(BAX和CASP3)表達。

圖3 支持細胞生長曲線Fig.3 Growth curve of sertoli cells

2.4 視黃醇對支持細胞內(nèi)細胞因子轉(zhuǎn)錄和表達的影響

收集添加視黃醇干預培養(yǎng)24 h和3 d后的支持細胞進行RT-PCR和ELISA檢測。RT-PCR結(jié)果顯示，GDNF、CSF-1、EGF、LIF和FGF2在支持細胞中均有轉(zhuǎn)錄和表達(圖5)。與對照組相比，視黃醇添加組支持細胞GDNF和CSF-1的基因表達量顯著下調(diào)(P<0.05)；EGF的基因表達量在培養(yǎng)3 d時顯著下調(diào)(P<0.05)，在培養(yǎng)24 h時與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。視黃醇添加對支持細胞內(nèi)LIF和FGF2的基因表達量無顯著影響(P>0.05)。

ELISA檢測結(jié)果表明(表2)，處理24 h時，視黃醇添加組細胞中GDNF含量顯著低于對照組(P<0.05)，CSF-1、EGF含量極顯著低于對照組(P<0.01)；處理3 d，視黃醇添加組細胞中CSF-1、FGF2含量顯著低于對照組(P<0.05)，GDNF、EGF含量極顯著低于對照組(P<0.01)。綜上所述，視黃醇可以顯著抑制GDNF、CSF-1和EGF的轉(zhuǎn)錄和合成。

a為目的基因電泳圖；b～f分別為PCNA、CASP3、C-MYC、BCL-2和BAX基因的相對表達量。a represented the expression of target genes; b-f represented relative expression levels of PCNA， CASP3， C-MYC， BCL-2 and BAX.圖4 支持細胞內(nèi)增殖和凋亡相關(guān)基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of proliferation and appotis related genes in sertoli cells

3 討論

視黃醇是最早發(fā)現(xiàn)的維生素之一，在機體生殖功能和免疫功能調(diào)節(jié)中都具有不可或缺的作用[1]，但大量的體外實驗發(fā)現(xiàn)，視黃醇對細胞表現(xiàn)出一定的毒性作用[20-23]。支持細胞是機體生殖功能調(diào)節(jié)的主要功能細胞[8]，機體內(nèi)支持細胞中視黃醇的生理水平維持在0.2～5.0 μmol·L-1之間[24-25]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在無血清的體外培養(yǎng)條件下，添加高濃度的視黃醇，會對睪丸支持細胞產(chǎn)生毒性作用，但由于細胞的獲取、來源、培養(yǎng)條件和視黃醇作用時間的不同，導致視黃醇對細胞的生物學功能影響呈現(xiàn)一定的差異。Oliveira等[22]發(fā)現(xiàn)，添加7 μmol·L-1視黃醇24 h后，大鼠睪丸支持細胞中超氧化物產(chǎn)生，并且使細胞發(fā)生形變，甚至會引起細胞DNA損傷[20]。Gelain等[21]發(fā)現(xiàn)，視黃醇添加濃度高于5 μmol·L-1時，對培養(yǎng)24 h后的大鼠睪丸支持細胞具有促氧化作用；當濃度達到14 μmol·L-1時，支持細胞活性受到顯著抑制。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在含6% FBS的體外培養(yǎng)條件下，低劑量的視黃醇(2～5 μmol·L-1)處理6 h后誘導HL-60細胞系DNA損傷[23]。上述研究均顯示，體外條件下添加視黃醇可以誘導細胞DNA損傷。DNA損傷是自發(fā)產(chǎn)生的過程，可被環(huán)境中的誘變因素加強，進一步干擾DNA復制和轉(zhuǎn)錄過程，從而導致細胞活性喪失，多細胞生物會對該過程做出選擇，使細胞程序性死亡[26]。在本試驗中，在含10%FBS的體外條件下，添加視黃醇對支持細胞活性具有顯著抑制作用，并且呈現(xiàn)時效性和劑量依賴性，增殖相關(guān)基因PCNA、BCL-2和C-MYC顯著下調(diào)，凋亡相關(guān)基因BAX顯著上調(diào)，這可能是視黃醇誘導了支持細胞DNA損傷，從而誘導細胞凋亡，導致細胞活性降低，其作用機理有待進一步研究。

a為目的基因電泳圖；b～f分別為GDNF、LIF、CSF-1、FGF2和EGF基因的相對表達量。a represented the expression of target genes; b-f represented relative expression levels of GDNF、LIF、CSF-1、FGF2 and EGF.圖5 支持細胞內(nèi)細胞因子相關(guān)基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of cytokines related genes in sertoli cells

表2ELISA法檢測細胞因子濃度

Table2Concentration of cytokines detected by ELISA

細胞因子cytokinest/d細胞內(nèi)濃度Concentration in cells/(ng·L-1)對照組 Control group處理組 Treatment group基質(zhì)中濃度Concentration in medium/(ng·L-1)對照組 Control group處理組 Treatment groupGDNF11 333.67±182.16 aA825.67±104.00 bA3 963.67±96.46 aA3 131.00±166.28 bB32 840.33±107.71 aA1949.67±135.21 bB689.67±141.20 aA464.33±160.38 bBLIF1782.21±34.70 aA703.77±118.13 aA771.14±33.96 aA476.90±71.70 bA3794.92±10.17 aA671.66±32.00 aA672.58±27.75 aA604.57±119.37 aACSF-11551.76±8.67 aA399.29±12.51 bB517.52±17.79 aA395.46±25.10 bB3412.01±4.42 aA387.26±10.22 bA378.18±1.95 aA357.17±9.11 aAFGF21341.33±21.37 aA312.73±9.51 aA228.837±9.61 aA220.217±13.63 aA3435.89±27.67 aA353.94±19.55 bA225.87±22.48 aA216.713±20.90 aAEGF11 564.41±69.40 aA1 140.88±48.94 bB1 366.95±179.61 aA953.79±51.21 bA31 683.18±26.06 aA1 343.32±64.01 bB1 278.49±66.22 aA1 342.47±72.68 aA

同行數(shù)據(jù)后無相同大、小寫字母的分別表示組內(nèi)差異極顯著(P<0.01)與顯著(P<0.05)。

In the same row， data marked without the same uppercase or lowercase letters indicated significant differences atP<0.01 andP<0.05， respectively.

強大分泌功能是支持細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要途徑之一，Marh等[27]將小鼠精母細胞與支持細胞的共培養(yǎng)，可以使早期的生殖細胞產(chǎn)生具有受精能力的精子，間接證明支持細胞在生殖細胞增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗對支持細胞中相關(guān)細胞因子進行了檢測分析，結(jié)果顯示，GDNF、LIF、CSF-1、FGF2和EGF在支持細胞中均有轉(zhuǎn)錄和合成，這些細胞因子是支持細胞發(fā)揮調(diào)控功能的重要基礎[14-16,18,28]，添加視黃醇對GDNF、CSF-1和EGF的轉(zhuǎn)錄和合成具有顯著抑制作用，說明添加視黃醇對支持細胞的分泌功能起抑制作用，這可能是該視黃醇濃度下引起支持細胞氧化損傷，導致細胞活性下降，從而使細胞分泌功能減弱，其作用機理有待進一步探究。

本試驗結(jié)果豐富了視黃醇對哺乳動物睪丸支持細胞體外生物學特性影響這一領(lǐng)域的研究，進一步闡明視黃醇在支持細胞內(nèi)代謝機理，以及為視黃醇作用于支持細胞后對雄性動物生殖功能的影響提供了理論依據(jù)。