改良熒光染色法在皮下真菌病組織病理診斷中的應(yīng)用分析

劉曉雨 梁官釗 郭健 段昕所 李保強(qiáng) 徐伊 王淑新 陸潔

1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，河北 067000；2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院真菌科，南京 210042

皮下真菌病往往需通過(guò)組織病理檢查來(lái)確診，傳統(tǒng)的染色方法主要有蘇木精-伊紅（HE）、過(guò)碘酸-雪夫（PAS）和六銨銀（GMS）染色法，這些方法操作步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、標(biāo)本易污染，漸難以滿足日益增加的臨床需求［1-2］。隨著熒光顯微鏡的普及，Calcofluor White（CFW）熒光染色劑開(kāi)始被應(yīng)用于真菌染色［3］。CFW 熒光染色劑有助于快速、靈敏、特異地檢出真菌，目前主要應(yīng)用于涂片標(biāo)本的直接鏡檢［3-4］，尚無(wú)用于皮下真菌病組織病理診斷的相關(guān)研究。本研究創(chuàng)新性地將CFW染色應(yīng)用于皮下真菌病的組織病理診斷，通過(guò)比較改良CFW 熒光染色法、HE染色法、PAS染色法和GMS染色法檢測(cè)皮下真菌病真菌的陽(yáng)性率，分析改良CFW 熒光染色法在皮下真菌病組織病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為皮下真菌病的診斷提供一種新的方法。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

回顧1987—2017年承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的21例皮下真菌病患者，其中女7例，男14例。感染部位位于頭面部2 例，上肢14 例（手部10 例，前臂4例），下肢5例（足背1例，腿部4例）。感染菌種為孢子絲菌12例，著色芽生菌3例，念珠菌1例，石膏樣癬菌1例，毛霉菌1例，菌種不明3例。所有患者均進(jìn)行過(guò)組織病理檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：①住院期間疑診為真菌感染，切取局部活組織和組織病理診斷并留有病理組織蠟塊；②病理組織蠟塊中組織保留較多，能夠切取足量可用切片；③住院期間在切取組織相同部位取皮下組織行真菌培養(yǎng)陽(yáng)性或組織病理切片行HE、PAS、GMS染色中任意一種染色真菌陽(yáng)性。

二、主要試劑

0.1%CFW 工作液（美國(guó)Sigma 公司），HE 染色劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），PAS 染色劑（北京雷根生物技術(shù)有限公司），GMS染色劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。陰性對(duì)照染色劑為10%KOH（天津永大化學(xué)試劑有限公司）。

三、方法

收集的石蠟包埋組織進(jìn)行平行試驗(yàn)，每塊組織連續(xù)切 4 張 4 μm 切片，1 張行改良 CFW 熒光染色，另3 張分別按常規(guī)行HE 染色、PAS 染色和GMS染色。

改良CFW熒光染色：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水稍洗，切片晾干；滴加CFW 熒光染色液，避光染色10 min；傾去染液，蒸餾水稍洗，行常規(guī)HE染色；蒸餾水稍洗，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封固，熒光顯微鏡下鏡檢。

陰性對(duì)照：以蒸餾水代替熒光染色液及KOH溶液，其余步驟同改良CFW熒光染色。

四、結(jié)果判定

改良CFW 染色陽(yáng)性：熒光顯微鏡下菌絲及孢子呈亮藍(lán)色，高倍鏡下或可見(jiàn)菌絲分隔，背景黑暗。HE 染色陽(yáng)性：可見(jiàn)真菌孢子呈橢圓形。PAS染色陽(yáng)性：真菌孢子呈橢圓形，孢子壁呈現(xiàn)紅色或紫紅色；真菌菌絲呈現(xiàn)紅色或紫紅色，菌絲不完整，呈節(jié)段性。GMS 染色陽(yáng)性：細(xì)胞和組織背景為紅色，真菌孢子、菌絲呈黑褐色或棕褐色，孢子圓形或橢圓形。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件，4種染色法診斷真菌感染陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、4種染色方法檢出皮下真菌病的陽(yáng)性率

21 例皮下真菌感染患者中，培養(yǎng)陽(yáng)性17 例（80.95%），改良CFW 熒光染色法檢出陽(yáng)性14 例（66.67%），HE 染色法陽(yáng)性5例（23.80%），PAS 染色法陽(yáng)性 6 例（28.57%），GMS 染色法陽(yáng)性 11 例（52.38%）。改良CFW 熒光染色法陽(yáng)性率高于HE染色（χ2= 6.718，P= 0.012）和 PAS 染色法（χ2=5.200，P= 0.029）。改良 CFW 熒光染色法與 GMS染色法陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.693，P=0.530）。

二、4種染色方法的鏡下表現(xiàn)

在紫外激發(fā)光（紫外線濾鏡）下，經(jīng)改良CFW染色法染色，孢子絲菌、念珠菌及未知菌種感染皮下組織中可見(jiàn)呈亮藍(lán)色菌絲及孢子，背景黑暗，真菌的形態(tài)特征清晰、明顯，陰性對(duì)照組背景黑暗，無(wú)熒光反應(yīng)（圖1）。1份標(biāo)本HE、PAS、GMS染色均呈陰性，而改良CFW染色法呈陽(yáng)性（圖2）。在4種染色方法均為陽(yáng)性的4份標(biāo)本中，改良CFW染色法與其余染色方法相比，真菌形態(tài)特征更清晰，與背景反差更明顯（圖2）。

著色芽生菌在HE、PAS、GMS染色法中可以相對(duì)容易找到，使用改良CFW 熒光染色法在紫外激發(fā)光下隱約可見(jiàn)硬殼小體的黑色輪廓，并非亮藍(lán)色。見(jiàn)圖2。

討 論

深部真菌感染患者病死率隨治療開(kāi)始時(shí)間的滯后而增高，及早給予經(jīng)驗(yàn)治療能挽救更多患者的生命，因此真菌感染的早期診斷是抗真菌治療成敗的關(guān)鍵［5］。在組織中判斷是否存在真菌感染，主要依靠病理石蠟切片的HE 染色及其他特殊染色，如GMS 及PAS 染色，再結(jié)合形態(tài)學(xué)進(jìn)行判斷。HE 染色雖能顯示真菌本身顏色和周?chē)M織結(jié)構(gòu)，但難以形成明顯對(duì)比，尤其對(duì)無(wú)色真菌的辨認(rèn)較差。GMS染色法涉及的試劑品種繁多，且染液需即用即配，染色過(guò)程繁復(fù)，如過(guò)染會(huì)導(dǎo)致其他組織成分著色，影響結(jié)果判定。PAS 染色法可能造成切片中組織細(xì)胞的共染現(xiàn)象，配置染液及染色過(guò)程繁瑣，且無(wú)法染色部分菌種［6-8］。因此，探索新的染色方法，對(duì)于提高真菌感染的檢查效率與檢出率十分必要。

圖1 不同真菌感染皮下組織及陰性對(duì)照經(jīng)改良熒光染色的鏡下表現(xiàn)（×400） 1A～1C：分別為孢子絲菌感染、念珠菌感染、未知真菌感染，組織中清晰可見(jiàn)呈亮藍(lán)色的菌絲及孢子；1D：陰性對(duì)照，無(wú)熒光反應(yīng)

圖2 皮下真菌病組織標(biāo)本改良熒光染色（CFW）、蘇木精-伊紅（HE）、過(guò)碘酸-雪夫（PAS）和六銨銀（GMS）染色的鏡下表現(xiàn)（×400） 孢子絲菌感染皮下組織改良CFW染色，真菌成分呈陽(yáng)性，而HE、PAS、GMS染色均呈陰性。菌種未明確的某一真菌感染組織CFW染色，孢子染成亮藍(lán)色，與黑暗背景對(duì)比明顯；HE染色孢子呈淡黃色，PAS染色孢子呈紫紅色，GMS染色孢子呈棕黑色。著色芽生菌感染的皮下組織CFW染色可見(jiàn)孢子呈黑色輪廓，HE染色可見(jiàn)厚壁著色孢子，PAS染色孢子呈紫紅色，GMS染色孢子呈棕黑色

CFW 是一種二苯乙烯類(lèi)化合物，能夠非特異性地結(jié)合真菌細(xì)胞壁的多種成分，如幾丁質(zhì)和纖維素的β 葡聚糖等。在355 nm 紫外光激發(fā)下，經(jīng)CFW 染色的真菌會(huì)迅速發(fā)出亮藍(lán)色熒光，而其他組織成分呈暗淡的灰藍(lán)色。CFW染色法早已成為國(guó)外實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)真菌的常用方法，其對(duì)培養(yǎng)真菌的染色能力最早于1962年被報(bào)道［9］，隨后在石蠟切片和冰凍切片中的應(yīng)用也得到證實(shí)［4］。國(guó)外多個(gè)研究證明［3，10-11］，CFW 熒光染色法對(duì)卡氏肺孢子蟲(chóng)囊腫、頭癬和白念珠菌感染具有很高的敏感性和特異性。目前國(guó)內(nèi)CFW熒光染色法在真菌病診斷上的應(yīng)用尚處于起步階段，研究也較為局限。楊通等［12］在21 例深部真菌?。òū茄?、食管、胃竇、肺部、膀胱）的組織病理檢測(cè)中，對(duì)比GMS 和PAS 染色法，CFW 熒光染色法的符合率達(dá)100%，且操作更簡(jiǎn)單易行。羅云鵬等［13］在淺部真菌病的診斷研究中指出，特敏增強(qiáng)熒光染色的檢出率顯著高于KOH 濕片法，也高于CFW 熒光染色。而在皮下真菌病的組織病理診斷上，國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)研究的報(bào)道。

我們應(yīng)用改良CFW熒光染色法檢測(cè)21例皮下真菌病患者組織中的真菌成分，以HE、PAS和GMS染色法為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)改良CFW 熒光染色法陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)的HE、PAS 染色法。雖然改良CFW 熒光染色法與GMS 染色法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異，但改良CFW熒光染色法步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，有更高的實(shí)用性。CFW 熒光染色法在紫外激發(fā)光下，鏡下菌絲及孢子呈亮藍(lán)色，背景黑暗，與其他染色方法相比較，真菌的形態(tài)特征清晰、明顯。在著色芽生菌等暗色真菌的檢出上，由于其硬殼小體結(jié)構(gòu)致密，其成分主要是葡聚糖，幾丁質(zhì)含量少，而CFW熒光染色劑主要結(jié)合的是真菌胞壁中的幾丁質(zhì)，在熒光顯微鏡下幾乎不能觀察到亮藍(lán)色熒光。這個(gè)結(jié)果同 Harrington與 Hageage［4］的研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)取材來(lái)源于我科1987—2017年30年間收集的皮下真菌病標(biāo)本，部分組織病理取材年限較久遠(yuǎn)，蠟塊保存欠佳，實(shí)驗(yàn)中需多次取材方可得到較為完整的病理組織，由于病理切片層次、部位不同，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)存在假陰性。受組織固定液不同批次等影響，染色效果可能受到一定影響；且科室尚不具備菌種小培養(yǎng)條件，部分組織大培養(yǎng)陽(yáng)性，但無(wú)法進(jìn)一步準(zhǔn)確確定菌種。本研究21例皮下真菌病患者中，CFW染色法陽(yáng)性率最高，檢出14例陽(yáng)性，7例陰性。假陰性結(jié)果可能來(lái)自于多次重復(fù)切片導(dǎo)致組織真菌成分遺失；實(shí)驗(yàn)操作步驟不夠熟練，對(duì)各個(gè)過(guò)程時(shí)間把握欠佳；組織學(xué)讀片經(jīng)驗(yàn)有限等。過(guò)度讀片，將皮膚組織中的彈力纖維、膠原纖維、染色過(guò)程中混入的棉物纖維等與真菌成分相混淆等可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)病理取材例數(shù)相對(duì)較少，尚需要進(jìn)行大數(shù)據(jù)研究，為臨床應(yīng)用提供更多的參考。

綜上，改良Calcofluor White熒光染色法是一種準(zhǔn)確、實(shí)用的真菌組織病理學(xué)診斷方法，雖前期投入相對(duì)較高，但其應(yīng)用不僅限于診斷，更可以拓展到真菌病的治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突