鍶對(duì)菠菜幼苗生長(zhǎng)、光合和抗氧化酶活性的影響

姚 凱 牛曉娟 徐 僡 敖家林

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

鍶(Sr)元素主要以化合物的形態(tài)出現(xiàn)在自然界，含鍶元素的礦石主要有天青石(SrSO4)和菱鍶礦(SrCO3)。鍶是土壤所含有的堿土元素中豐度最小的化學(xué)元素，但隨著核工業(yè)[1]和現(xiàn)代交通[2-3]的快速發(fā)展，其含量在特定區(qū)域的土壤中呈較大幅度增加。光合作用是植物生長(zhǎng)和積累的基礎(chǔ)生理過(guò)程，外部環(huán)境的變化會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響。研究表明，重金屬會(huì)抑制抗氧化酶活性， 破壞質(zhì)膜系統(tǒng)，抑制光合電子傳遞，影響光系統(tǒng)Ⅱ活性等[4-5]。鈣元素在光合反應(yīng)過(guò)程中具有重要的作用，是光合系統(tǒng)和一些光合酶的結(jié)構(gòu)成分[6]。而鍶和鈣在化學(xué)物理性質(zhì)上非常相似，因此在植物細(xì)胞內(nèi)的一些代謝過(guò)程中鍶能夠替代鈣的功能[7-8]。土壤中的鍶不但會(huì)影響農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，還能夠在生物體內(nèi)富集并通過(guò)食物鏈累積放大[9]。鍶被人體攝入后，取代鈣集聚在骨骼上，可誘導(dǎo)白血病或其他腫瘤的發(fā)生[10]，過(guò)多的鍶攝入會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生危害。研究發(fā)現(xiàn)植物可通過(guò)根系對(duì)鍶進(jìn)行吸收，且吸收能力與其種屬有關(guān)[11-12]。姜曉燕等[10]研究表明，相同條件下，不同種屬植物對(duì)鍶富集的能力存在差異，表現(xiàn)為葫蘆科>豆科>禾本科。此外，植物對(duì)鍶的吸收還受土壤物理化學(xué)性質(zhì)的強(qiáng)烈影響[13-14]。鍶通過(guò)根系吸收后隨著木質(zhì)部的蒸騰流而轉(zhuǎn)運(yùn)，最后固定在植物的韌皮部[15]。研究表明，植物不同器官對(duì)鍶的富集能力存在差異，一般表現(xiàn)為根部>葉片>莖部[16-17]。

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)是我國(guó)常見的藜科蔬菜之一，以葉片作為主要的食用部位。Soudek等[18]研究發(fā)現(xiàn)植物對(duì)鍶的放射性同位素(90Sr)和穩(wěn)定性同位素(88Sr)的吸收無(wú)明顯差異。本研究以菠菜幼苗為試驗(yàn)材料，用不同濃度穩(wěn)定鍶同位素化合物SrCl2對(duì)其進(jìn)行處理，測(cè)定其生長(zhǎng)參數(shù)、光合指標(biāo)和抗氧化酶系統(tǒng)的響應(yīng)情況，以期為闡明鍶環(huán)境對(duì)植物的生長(zhǎng)生理的影響機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

供試材料：圓葉型菠菜(春新超全)，購(gòu)自貴陽(yáng)市種子公司。

選取籽粒飽滿的種子，置于裝有一定體積珍珠巖的育苗盒中，種子上覆蓋珍珠巖的薄層，向育苗盤的盛水盒中注入一定量的蒸餾水，以不浸泡種子為宜，保持培養(yǎng)室溫度25℃、光照14 h，光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1PPFD。約7 d后，種子開始萌發(fā)，待幼苗長(zhǎng)出4片葉片時(shí)，選取生長(zhǎng)茁壯的幼苗移植到12孔育苗盒中，每個(gè)育苗盒栽培2株幼苗以保持適當(dāng)間距，保證幼苗在試驗(yàn)過(guò)程中互相不影響光照。移苗后，將種植有植株的育苗盒置于人工氣候室內(nèi)，設(shè)置光周期為12 h，光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-2PPFD，溫度為25℃，相對(duì)濕度為55%～65%。菠菜幼苗采用水培方式培養(yǎng)，以1/2濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為植物幼苗提供營(yíng)養(yǎng)和水分。

萌發(fā)后約30 d，植株生長(zhǎng)至8葉齡時(shí)，去除生長(zhǎng)差異較大的植株后，在營(yíng)養(yǎng)液中分別加入0(CK)、0.1、0.5和2.5 mmol·L-1SrCl2，用0.2 mol·L-1NaOH將處理液pH值調(diào)至7.8。每天在取樣和測(cè)試各指標(biāo)后對(duì)處理液進(jìn)行更換。分別于第5、第10、第15和第20天對(duì)植株地上部分鮮重和光合指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量，并采集寬度為30 mm左右的葉片，-80℃保存，用于測(cè)量植株葉片在模擬鍶脅迫下的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。每個(gè)處理均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 植株地上部分鮮重測(cè)定

本試驗(yàn)選取植物地上部分鮮重作為衡量植物生長(zhǎng)情況的參數(shù)。收獲后立即分離植株地上部分和地下部分，用蒸餾水將植株地上部分洗凈，用吸水紙擦干后立即稱量。

1.3 植株葉片光合指標(biāo)測(cè)定

采用LI-6400XT便攜式光合測(cè)量系統(tǒng) (LI-COR公司，美國(guó))測(cè)定植株葉片的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、胞間二氧化碳濃度(intercellular CO2concentration，Ci)等光合參數(shù)，每次平行測(cè)定同一處理?xiàng)l件下的3株植株，每株測(cè)定2片葉片寬度為30～40 mm的葉片，每個(gè)葉片重復(fù)測(cè)定3次。采取人工設(shè)定測(cè)定條件的方式，設(shè)置測(cè)定光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-1PPFD，溫度25℃，CO2濃度為400 μmol·mol-1。測(cè)定時(shí)間為14:00-16:00，避開植物可能產(chǎn)生午休現(xiàn)象的時(shí)間。

1.4 葉綠素含量測(cè)定

參照王學(xué)奎等[19]的方法測(cè)定菠菜葉片的葉綠素含量。稱取0.1 g葉片加液氮研磨為碎片，加10 mL 80%丙酮混勻，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液1 mL，加入3 mL丙酮，分別于663、645 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，按照公式計(jì)算葉綠素a濃度(Ca)和 葉綠素b濃度(Cb)：

Ca= 12.21 A663-2.81A645

(1)

Cb= 20.13 A645-5.03A663

(2)。

1.5 植株葉片相關(guān)抗氧化酶活性測(cè)定

參照彭方仁等[20]的方法并稍作修改。稱取植物葉片鮮重0.1 g于預(yù)冷研缽中，加入1 mL預(yù)冷的0.05 mol·L-1pH值 7.8的磷酸緩沖液，在冰浴條件下研磨至勻漿，離心管收集勻漿后用緩沖液定容至2 mL，4℃下 1 000×g離心20 min，取上清液冷藏待測(cè)。

1)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定：參照Z(yǔ)hang等[21]的方法并稍做修改。通過(guò)測(cè)量抑制硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)的光化學(xué)還原能力來(lái)測(cè)定SOD活性，測(cè)定緩沖液含有0.3 mL 20 μmol·L-1核黃素、0.3 mL 150 mmol·L-1L-蛋氨酸、0.3 mL 600 μmol·L-1NBT和0.1 mL酶提取液，最后形成1 mL酶反應(yīng)體系。采用BlueStar紫外可見分光光度計(jì)(LABTECH公司，美國(guó))測(cè)定560 nm波長(zhǎng)下吸光度值。整個(gè)酶反應(yīng)在強(qiáng)度為170 μmol·m-2·s-1PPFD的光照下持續(xù)反應(yīng)20 min。以抑制 50%NBT發(fā)生光化學(xué)還原為 1個(gè)酶活性單位。

2)過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性測(cè)定：參照郝建軍等[22]的方法并稍做修改。將0.2 mL酶提取液和40 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚、3% H2O2、100 mmol·L-1pH 值6.5磷酸鉀緩沖液形成2 mL酶反應(yīng)體系，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定470 nm波長(zhǎng)下吸光度。

3)過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性測(cè)定：參照郝建軍等[22]的方法并稍作修改。將0.1 mL酶提取液和50 mmol·L-1磷酸緩沖液、3%H2O2形成1 mL酶反應(yīng)體系，采用紫外可見分光光度計(jì)于240 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，連續(xù)測(cè)定5 min。

1.6 丙二醛含量測(cè)定

參照Z(yǔ)heng等[23]的方法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量：稱取植物葉片0.1 g，加入2 mL 0.1%(w/v)三氯乙酸研磨為勻漿，4℃下 5 000×g離心10 min。取上清液1 mL，加入1 mL 0.5%(w/v)硫代巴比妥酸制成混合液，100℃反應(yīng)20 min，然后在冰浴中迅速冷卻，8 000×g離心10 min，取上清液分別于450、532和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。按照公式計(jì)算MDA含量(μmol·L-1)：

MDA含量=6.45(OD532-OD600)-0.56 OD450

(3)。

1.7 葉片鍶濃度測(cè)定

稱取采集的植物樣本5 g，60℃充分烘干。烘干后研磨成細(xì)末，過(guò)100目篩。采用濕法消解法 [HNO3+HClO4(3∶1，v/v)]消解，然后采用AA320火焰原子吸收分光光度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測(cè)量樣品中Sr含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 22.0 進(jìn)行ANOVA分析，組間差異進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)，以P<0.05作為顯著性依據(jù)；Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sr2+對(duì)菠菜幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菠菜地上部分生物量與CK均無(wú)顯著差異。0.5 mmol·L-1SrCl2處理對(duì)植株的生長(zhǎng)先表現(xiàn)出促進(jìn)作用，在處理第10天較CK顯著上升16%；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菠菜幼苗生長(zhǎng)受到一定的抑制，在第20天較CK顯著下降10%。2.5 mmol·L-1SrCl2處理對(duì)菠菜幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，第5天較CK下降12%，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果越明顯，第20天時(shí)較CK顯著下降48%。

表1 不同Sr2+處理濃度下菠菜幼苗(單株)地上部分生物量Table 1 The aboveground part biomasses of Spinacia oleracea L. seedlings (individual plant) under different Sr2+ treatments /(g FW)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same colum indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.

2.2 Sr2+對(duì)菠菜幼苗光合指標(biāo)的影響

由圖1-A可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理的Pn與CK相比，未表現(xiàn)出顯著的差異。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，Pn呈先升高后降低的趨勢(shì)，處理第5天達(dá)到最高，較CK上升5%，隨后逐漸下降，處理第20 天時(shí)較CK降低15%。2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，菠菜幼苗的Pn急劇下降，處理第15天趨于穩(wěn)定，較CK下降35%。Ci與Pn為相對(duì)應(yīng)關(guān)系，Pn高時(shí)，胞間CO2被快速消耗；Pn低時(shí)，CO2在細(xì)胞間積累。由圖1-B可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，Ci迅速下降，在處理第5～第10天略有上升，處理第10天后Ci隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，在處理第20天達(dá)到最低，較CK下降21%；0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，Ci呈先下降后升高的趨勢(shì)，在處理第5天最低，為CK的87%，在處理第20天最高，較CK上升13%。2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，菠菜幼苗的Ci隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)上升，處理第20天較CK上升38%。結(jié)果表明，低濃度的Sr2+對(duì)菠菜光合能力有一定促進(jìn)作用，而高濃度的Sr2+會(huì)抑制植株的光合作用。

圖1 Sr2+處理對(duì)菠菜幼苗的光合參數(shù)的影響Fig.1 Effect of Sr2+ treatments on photosynthetic parameters of Spinacia oleracea L. seedlings

2.3 Sr2+對(duì)菠菜幼苗葉綠素含量的影響

由圖2可知，SrCl2處理下，菠菜葉片中葉綠素a和葉綠素b整體變化趨勢(shì)有一定差異。但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素a和葉綠素b含量與CK相比均明顯下降且Sr2+處理濃度越高下降幅度越大。在處理第20天，0.1、0.5和2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，葉綠素a含量CK分別下降5%、9%和22%，葉綠素b含量較CK分別下降6%、21%和40%。結(jié)果表明，Sr2+處理對(duì)菠菜葉片中葉綠素a和葉綠素b含量均有抑制作用，且對(duì)葉綠素b的抑制效果要高于葉綠素a。

圖2 Sr2+處理對(duì)菠菜幼苗的葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of Sr2+ treatments on chlorophyll contents of Spinacia oleracea L. seedlings

2.4 Sr2+對(duì)菠菜幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3-A可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理的SOD活性與CK相比無(wú)明顯差異；0.5 mmol·L-1SrCl2處理的SOD活性從處理第5天開始逐漸上升，在處理第20天達(dá)到最高，較對(duì)照增加56%；2.5 mmol·L-1SrCl2處理的SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在處理第15天達(dá)到最高，較CK增加102%，隨后急劇下降。由圖3-B可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，POD活性與CK相比無(wú)明顯差異；0.5 mmol·L-1SrCl2處理的POD活性呈先下降后上升的趨勢(shì)，在處理第20天達(dá)到最高，較CK增加37%；2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，POD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在處理第15天達(dá)到最高，較CK增加128%，隨后急劇下降。由圖3-C可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，CAT活性與CK相比無(wú)明顯差異； 0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，CAT活性在處理第5天后逐漸上升，在處理第20天達(dá)到最高；2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，CAT活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第15天達(dá)到最高，較CK增加54%，隨后急劇下降。結(jié)果表明，環(huán)境中Sr2+濃度的升高增強(qiáng)了對(duì)植物的氧化脅迫。SOD、POD和CAT活性對(duì)Sr2+脅迫表現(xiàn)出較為一致的變化規(guī)律。

圖3 Sr2+處理對(duì)菠菜幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of Sr2+ treatments on antioxidative enzyme activities of Spinacia oleracea L. seedlings

2.5 Sr2+對(duì)菠菜幼苗MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量能夠反映植物細(xì)胞在脅迫下受到傷害的程度。由圖4可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，菠菜葉片中的MDA含量較CK無(wú)明顯變化；0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，MDA含量在處理第5天后開始升高，在處理第20天達(dá)到最高；2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，MDA含量快速上升，處理第20天的MDA含量較CK增加68%。結(jié)果表明，環(huán)境中Sr2+濃度越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，植物細(xì)胞膜受到的氧化傷害越強(qiáng)。

圖4 Sr2+處理對(duì)菠菜幼苗的MDA含量的影響Fig.4 Effect on Sr2+ treatments of of Spinacia oleracea L. seedlings

2.6 不同濃度Sr2+處理下菠菜葉片中Sr2+的積累濃度

環(huán)境中的鍶能夠被植物通過(guò)根系吸收并在體內(nèi)積累。由圖5可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，菠菜葉片中的Sr2+積累濃度未隨著時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生明顯變化，基本保持在35 mg·kg-1左右；0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，Sr2+積累濃度隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，在處理第20天達(dá)到最高，為318.33 mg·kg-1；2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，植物葉片中Sr2+積累濃度隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升，在處理第20天達(dá)到最高，為857.51 mg·kg-1。

圖5 菠菜葉片中Sr2+的積累濃度Fig.5 Sr2+ concentrations in Spinacia oleracea L. leaves

3 討論

研究表明，葉片是吸收與富集Sr2+的主要器官[24, 16]，也是植物進(jìn)行光合生長(zhǎng)的重要器官。本研究中，0.5 mmol·L-1SrCl2處理初期，菠菜葉片的Pn有所上升。這與前人研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的Sr2+處理能夠增強(qiáng)植物光合能力的結(jié)論一致[25]。本研究中，Sr2+處理對(duì)菠菜葉片中葉綠素a和葉綠素b含量均有抑制作用，其中葉綠素b對(duì)Sr2+處理更為敏感，這與前人研究結(jié)果相同[26-27]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)植物光合能力的變化與葉綠素a和葉綠素b含量的變化趨勢(shì)并不完全一致，表明Sr2+處理可能對(duì)光合作用的其他過(guò)程產(chǎn)生了影響，具體情況還有待進(jìn)一步研究。

環(huán)境脅迫可破壞植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的平衡機(jī)制，從而使活性氧簇(eactive oxygen species, ROS)過(guò)量積累，導(dǎo)致植物體發(fā)生一系列氧化脅迫現(xiàn)象。植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)清除ROS具有重要的作用，SOD、POD和CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性能夠影響逆境下葉綠素、蛋白質(zhì)的降解速度及葉片功能，與植物的抗逆性密切相關(guān)。本研究中，Sr2+處理下的SOD、POD和CAT活性的變化規(guī)律較為一致，均隨著Sr2+處理濃度的增加明顯上升，表明Sr2+處理對(duì)植物產(chǎn)生了氧化脅迫的作用；且在2.5 mmol·L-1SrCl2處理后期，SOD、POD和CAT活性均出現(xiàn)大幅度下降，這可能是在長(zhǎng)時(shí)間高濃度的Sr2+處理下，氧化脅迫導(dǎo)致植物整體的生理功能下降所致。ROS對(duì)不飽和脂肪酸氧化或過(guò)氧化，生成脂質(zhì)過(guò)氧化物，脂質(zhì)過(guò)氧化物進(jìn)一步降解成MDA[28]。MDA是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化傷害的主要產(chǎn)物之一，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其含量能夠反映膜脂過(guò)氧化水平和膜結(jié)構(gòu)的傷害程度[29]。本研究中，高濃度長(zhǎng)時(shí)間的Sr2+處理使細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯上升，這可能是由于植物根系不斷吸收Sr2+，導(dǎo)致Sr2+在植物體內(nèi)富集量增加，從而對(duì)植物的傷害作用也隨之增強(qiáng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)隨著Sr2+處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用不斷增強(qiáng)，但0.1 mmol·L-1SrCl2處理對(duì)植物生長(zhǎng)及生理指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯影響，這可能與Sr2+處理的濃度較低及試驗(yàn)材料處于快速生長(zhǎng)期有關(guān)。生物量的快速增加稀釋了Sr2+在植物葉片內(nèi)的濃度，使其對(duì)植物產(chǎn)生的生理影響降低；而在較高濃度的鍶處理下，Sr2+在植物葉片中快速積累，并對(duì)植物的生長(zhǎng)生理產(chǎn)生了較大影響。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，低濃度的Sr2+處理對(duì)菠菜的光合能力表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，但是隨著Sr2+處理濃度的增強(qiáng)和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Sr2+對(duì)菠菜的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，這種抑制作用也同時(shí)體現(xiàn)在菠菜的光合能力和氧化脅迫響應(yīng)上。同時(shí)，Sr2+處理濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)、Sr2+在菠菜葉片內(nèi)的富集量越多，對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用也越強(qiáng)，但植物葉片內(nèi)低濃度的Sr2+富集對(duì)菠菜生長(zhǎng)的影響并不明顯。