滑液炎癥因子IL-15、IL-17、IL-18的表達(dá)對髁突骨質(zhì)缺損的診斷意義

賈夢瑩， 許穎捷， 曾雪敏， 龔忠誠

(1新疆醫(yī)科大學(xué)， 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/附屬口腔醫(yī)(學(xué))院頜面腫瘤外科， 3新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所， 烏魯木齊 830054)

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病(temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA)多由結(jié)構(gòu)紊亂病(internal derangement，ID)發(fā)展而來，為顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的晚期階段，以關(guān)節(jié)區(qū)疼痛，張口受限為主要臨床表現(xiàn)，影響患者的生活質(zhì)量，主要病理學(xué)表現(xiàn)為髁突軟骨不同程度的破壞、退變，關(guān)節(jié)進(jìn)行性損傷，滑膜慢性炎癥[1]。然而ID亦可伴隨炎癥反應(yīng)，目前ID與TMJOA的關(guān)系仍存在部分在爭議[2]，由于ID與骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)沒有特意性的診斷指標(biāo)，單純通過錐束計(jì)算機(jī)斷層掃描(cone beam computed tomography，CBCT)檢查，觀察髁突骨質(zhì)結(jié)構(gòu)與關(guān)節(jié)腔間隙的變化[3]，指導(dǎo)關(guān)節(jié)腔玻璃酸鈉注射，使得顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的治療缺乏特異性，可能造成過度治療的發(fā)生。由此探索特異性診斷OA的指標(biāo)尤為重要。

髁突是顳下頜關(guān)節(jié)重要組成部分，其結(jié)構(gòu)的完整性有賴于生長的微環(huán)境，髁突軟骨由滑膜分泌滑液所滋養(yǎng)，滑液的成分直接影響髁突生長的微環(huán)境，目前髁突骨質(zhì)的破壞多聚焦于促炎因子與抑炎因子、合成代謝與分解代謝的失衡，因此滑液的炎性指標(biāo)對診斷OA具有重要意義，白介素1β(interlukin-1β，IL-1β)以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)等促炎因子與髁突退行性變成正相關(guān)已經(jīng)被闡明[4]，其通過誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解，抑制蛋白多糖的合成，促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞的凋亡，加速滑膜炎癥，髁突骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。而白介素15(interlukin-15，IL-15)、白介素17(interlukin-17，IL-17)、白介素(interlukin-18，IL-18)是近年在膝關(guān)節(jié)等大關(guān)節(jié)滑液中研究較多的致炎因子，由于顳下頜關(guān)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)與原發(fā)性膝關(guān)節(jié)存在不同，其可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制[5]，滑液表達(dá)量亦存在差異，故本研究主要篩查在原發(fā)性關(guān)節(jié)中具有促炎作用的炎癥因子IL-15、IL-17、IL-18在伴髁突骨質(zhì)缺損OA與不伴髁突骨質(zhì)缺損ID患者關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)差異，為特異性診斷骨關(guān)節(jié)病提供線索，并且為OA的發(fā)病機(jī)制及治療提供靶向治療的新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)納入各組研究對象，要求患者均來自2018年10月-2019年4月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院顳下頜關(guān)節(jié)專病門診及頜面外科專家門診且由同一專家診斷為TMD的患者。根據(jù)臨床表現(xiàn)以及CBCT檢查，篩查出無髁突骨質(zhì)破壞的ID組與髁突骨質(zhì)缺損OA組, 每組各30例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無自身免疫性疾病或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；(2)近期無服用激素及免疫類藥物；(3)近期無顳下頜關(guān)節(jié)外傷病史；(4)非妊娠期及哺乳期婦女患；(5)無嚴(yán)重的心血管、肝、腎及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。?6)非惡性腫瘤患者；(7)非急性或慢性感染期患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)凡不滿足上訴要求者；(2)滑液存在血液干擾者；(3)不愿意配合關(guān)節(jié)腔治療的患者。

1.2 研究分組本研究將研究對象分為2組，每組30例，無髁突骨質(zhì)破壞的ID組：即有關(guān)節(jié)癥狀，根據(jù)診斷RDC/TMD[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)可診斷為顳下頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂病，且CBCT影像學(xué)檢查，未見髁突骨質(zhì)破壞者，共30例。伴髁突骨質(zhì)破壞OA組：不伴有其他結(jié)構(gòu)異常者，且根據(jù)CBCT檢查，可見病變側(cè)髁突骨質(zhì)不連續(xù)以及毛刺、囊性變、骨贅增生、硬化、吸收等，均可納入，共30例。

1.3 研究方法

1.3.1 滑液收集與凍存 上述患者均行關(guān)節(jié)腔盥洗術(shù)與關(guān)節(jié)腔玻璃酸鈉注射治療術(shù)收集關(guān)節(jié)盥洗液為滑液。(1)關(guān)節(jié)腔盥洗及玻璃酸鈉注射術(shù)：告知患者及家屬關(guān)節(jié)腔注射的意義，獲取患者知情同意，簽署知情同意書后行注射治療?；颊呷∽筋^側(cè)位，耳屏前常規(guī)消毒，頭偏向健側(cè)，患側(cè)耳屏前1 cm處使用3 mL利多卡因穿刺，麻醉盥洗，穿刺時(shí)針尖斜向前、上、內(nèi)，抵髁突后斜面后退約1 mm，回抽，推注藥物，回抽，沖洗關(guān)節(jié)腔中的免疫物質(zhì)，收集滑液，隨后同一位點(diǎn)注射玻璃酸納1.5 mL(總體積為2.5 mL，一般注射1.5 mL)。(2)收集好關(guān)節(jié)滑液后，離心機(jī)離心(12 000 r/min，15 min，4℃)后取上清液，于-80°冰箱凍存。

1.3.2 檢測內(nèi)容 (1)相關(guān)炎癥因子包括IL-15、IL-17、IL-18，采用高敏感度、高特異性的夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定2組關(guān)節(jié)液中IL-15、IL-17、IL-18的表達(dá)差異。嚴(yán)格按照(武漢博士德)IL-15、IL-17、IL-18的ELISA試劑盒操作程序進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀分析法在酶標(biāo)儀上于 450 nm處測 OD值。檢測時(shí)以空白對照孔調(diào)零后測各孔的 OD 值，若樣品孔中的 OD 值大于陰性對照孔的 2.1 倍，即為陽性。(2)測定結(jié)果分析：計(jì)算各樣品的OD值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將樣品的OD值帶入回歸方程，求出濃度，統(tǒng)計(jì)錄入。

1.3.3 質(zhì)量控制 同一位臨床診療經(jīng)驗(yàn)豐富的顳下頜關(guān)節(jié)專家對患者行關(guān)節(jié)腔玻璃酸鈉注射術(shù)及關(guān)節(jié)腔盥洗術(shù)；局部利多卡因注射量相同，回抽滑液總體積相同。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病患者共60例，伴髁突骨質(zhì)破壞OA組與不伴髁突破壞ID組患者各30例，男性23例，女性37例，不伴髁突破壞ID組患者中可復(fù)性盤前移位19例，不可復(fù)性盤前移位患者11例。

2.2 IL-15、IL-17、IL-18的表達(dá)IL-15、IL-17、IL-18在上述2組患者的滑液中的表達(dá)見表1，IL-15在伴髁突骨質(zhì)破壞的骨關(guān)節(jié)病與不伴髁突骨質(zhì)破壞的結(jié)構(gòu)紊亂病組均有低濃度表達(dá)，2組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而IL-17、IL-18在伴髁突骨質(zhì)破壞的骨關(guān)節(jié)病組高濃度表達(dá)，而在不伴髁突骨質(zhì)破壞的結(jié)構(gòu)紊亂病組低濃度表達(dá)，2組表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 不伴髁突骨質(zhì)破壞的ID組與伴髁突骨質(zhì)破壞的 OA組滑液中IL-15、IL-17、IL-18的表達(dá)濃度(pg/mg)

3 討論

本研究通過滑液炎癥因子的分析，表明了IL-17、IL-18高表達(dá)于伴髁突骨質(zhì)破壞OA組，高表達(dá)的IL-17、IL-18可能改變了顳下頜關(guān)節(jié)的局部微環(huán)境，參與髁突退變，對髁突骨質(zhì)破壞具有診斷意義；而低濃度表達(dá)的IL-15在2組表達(dá)無差異，顳下頜關(guān)節(jié)滑液僅能檢出微量的IL-15，提示IL-15對TMJOA的診斷意義不大。IL-15、IL-17、IL-18都是促炎因子，IL-15的檢出濃度低可能與顳下頜關(guān)節(jié)滑液量小，局部組織來源較少有關(guān)，其次IL-15的研究在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、以及免疫系統(tǒng)性疾病的致炎作用較成熟，本研究IL-15表達(dá)量檢出較少可能與顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病中免疫炎癥細(xì)胞參與量少有相關(guān)性。而IL-17、IL-18的高表達(dá)可能與其在關(guān)節(jié)炎中已證明的致炎機(jī)制密切聯(lián)系，在顳下頜關(guān)節(jié)中局部存在強(qiáng)烈致炎作用。

IL-17、IL-18在骨性關(guān)節(jié)炎中的致炎機(jī)制已被部分闡明，相關(guān)研究報(bào)道IL-17是主要由輔助性Th17細(xì)胞產(chǎn)生的以二聚體形式存在的促炎因子，通過激活中性粒細(xì)胞和引導(dǎo)前炎性因子發(fā)揮致炎作用，在誘導(dǎo)軟骨破壞方面，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞分泌破壞細(xì)胞基質(zhì)為主的基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)軟骨細(xì)胞釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)，介導(dǎo)軟骨破壞，軟骨細(xì)胞基質(zhì)的降解；在誘導(dǎo)骨破壞方面，可促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factors kappa B，NF-κB)配體受體激動劑，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞形成及骨侵蝕[7]；在誘導(dǎo)軟骨凋亡方面，IL-17亦可與其受體結(jié)合活化軟骨細(xì)胞核因子NF-κB，進(jìn)一步通過此途徑促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)改變，產(chǎn)生凋亡反應(yīng)。除此IL-17可以增加關(guān)節(jié)炎軟骨中軟骨血管生成[9]，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)量，引導(dǎo)免疫細(xì)胞參與，加速局部炎癥反應(yīng)。IL-17亦與致炎因子存在協(xié)同作用，研究表明IL-17局部上調(diào)IL-8與IL-1β的表達(dá)[10]，形成一個(gè)炎癥放大的網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)軟骨進(jìn)一步損傷。

IL-18是以非活性前體存在的致炎因子，參與固有免疫及體液免疫，IL-18可誘導(dǎo)輔助性 T 細(xì)胞產(chǎn)生干擾因子-γ和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，促進(jìn) T 細(xì)胞增殖，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的作用，加強(qiáng) T細(xì)胞表面抗原介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，參與組織炎癥損傷反應(yīng)[11],同時(shí)IL-18也是細(xì)胞焦亡釋放的必要炎性因子。相關(guān)研究證明IL-18在骨關(guān)節(jié)病的發(fā)展中，通過與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)IL-1β，TNF-α等強(qiáng)烈致炎作用的炎癥因子產(chǎn)生，進(jìn)一步刺激NO，前列腺素E2的產(chǎn)生，誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解，抑制蛋白多糖的合成，促進(jìn)顳下頜關(guān)節(jié)破壞[12]，其次通過IL-18與T細(xì)胞表面受體結(jié)合，啟動胞內(nèi)信號通路，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，放大免疫炎癥反應(yīng)。

研究證明IL-17、IL-18在膝關(guān)節(jié)炎滑液中均較正常人較高表達(dá)[13]，與關(guān)節(jié)病變的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。通過上述 IL-17、IL-18在骨關(guān)節(jié)炎中的致炎基礎(chǔ)，與本實(shí)驗(yàn)伴骨質(zhì)破壞的骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中IL-18、IL-17的高濃度表達(dá)相一致，證明了IL-17、IL-18 2種致炎因子的診斷意義，可能是加速髁突骨質(zhì)破壞的原因。促炎因子并不是獨(dú)立存在，而是相互協(xié)同放大局部免疫炎癥反應(yīng)，髁突生長的內(nèi)環(huán)境改變，引起關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，纖維松解，膠原纖維暴露，軟骨成分被免疫識別，局部產(chǎn)生抗體、免疫復(fù)合物，刺激體液以及細(xì)胞免疫，惡性循環(huán)不斷往復(fù)，導(dǎo)致 TMD 病程遷延，進(jìn)一步破壞，髁突形態(tài)完全受損。本研究提示IL-17、IL-18可能根據(jù)上述某種致炎機(jī)制參與軟骨破壞的惡性循環(huán)，IL-17、IL-18的高濃度表達(dá)對髁突骨質(zhì)破壞意義重大，目前靶向藥物治療研究趨于成熟，在針對疾病的特異性治療方面具有指導(dǎo)意義。通過IL-17，IL-18相關(guān)途徑的抑制劑治療可能成為TMJOA治療的新靶點(diǎn)，可以使顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的個(gè)體化治療成為現(xiàn)實(shí)。